基于生物信息学分析肾透明细胞癌中植物同源结构域指蛋白6的表达及临床意义△

于建宇，方爱钟，郑义，于春娜，彭怡琛，林艺，汪晓敏#，李文斌,#

1首都医科大学附属北京天坛医院神经肿瘤综合治疗病区，北京 100071

2首都医科大学健康医疗大数据国家研究院，北京 100069

肾细胞癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其中最常见的亚型是肾透明细胞癌（renal clear cell carcinoma，KIRC），占所有肾细胞癌类型的70%～80%[1-2]，是一种恶性程度相对较低、发展缓慢的肿瘤。手术是KIRC 的主要治疗手段，但大多数情况下，即使进行了早期手术治疗，仍有30%转移的可能[3-6]。KIRC 已被证明与免疫微环境[7]、广泛的肿瘤特异性遗传和表观遗传学改变有关[8]，这些改变可导致许多肿瘤相关基因表达水平的改变。因此，迫切需要对KIRC 的敏感基因进行研究，以寻找有效的治疗靶点及预后的分子标志物，进而有助于早期诊断，并为KIRC 早期干预提供依据。

植物同源结构域指蛋白6（plant homeodomain finger protein 6，PHF6）定位于人染色体Xq26.3，是一种核仁、核糖体RNA 启动子相关蛋白，该蛋白具有2 个植物同源结构域[9]，定位于细胞核中，并在脊椎动物中高度保守[10]。PHF6 表达异常与肿瘤发生发展相关，研究表明，PHF6编码核仁和染色质相关的白血病抑制因子，其表达缺失会导致染色质可及性及核小体定位的局灶性变化[11]，PHF6 表达缺失极大地损害了G2期细胞检查点的恢复[12]。随着基因研究的不断深入，PHF6 在血液病中的作用，特别是对血液肿瘤的抑制作用也逐渐受到关注[13]，并取得了一定的成果。但目前临床对KIRC 与PHF6 间的关系知之甚少。

本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中KIRC 患者的临床特征及RNA-seq 高通量测序信息，分析PHF6在KIRC 中的表达及与患者预后的关系，从而分析PHF6表达与KIRC 间的关系，并通过免疫组化法进一步验证PHF6的表达与肿瘤相关基因间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 数据来源及处理

从TCGA 数据库（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）下载535 例KIRC组织及72 例正常肾组织的数据及患者的病历资料；从基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）数据库（https://commonfund.nih.gov/gtex）下载28 例正常肾组织的数据及患者的病历资料。由于部分数据有缺失，共统计到535 例KIRC患者的部分临床特征、100 例正常肾组织和535 例KIRC 组织的RNA-seq 数据、535 例KIRC 患者的总生存期（overall survival，OS）、532 例KIRC 患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS）、530例KIRC 患者的疾病特异性生存期（disease-specific survival，DSS）资料。此外，自上海超芯生物科技有限公司购买KIRC 组织及癌旁组织共150 个微阵列的石蜡切片，由于部分矩阵的病历资料缺失，共统计到146 个微阵列的年龄和性别、148 个微阵列的组织学分级和临床分期的资料。

首先比较TCGA 数据库下载的72 例正常肾组织与535 例KIRC 组织中的PHF6表达情况；再加上GTEx 数据库下载的28 例正常肾组织，比较100例正常肾组织与535 例KIRC 组织中PHF6的表达情况，并比较不同临床特征KIRC 患者KIRC 组织中PHF6的表达情况。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，计算曲线下面积（area under the curve，AUC），评估PHF6表达对KIRC 的诊断价值。依据PHF6表达水平的中位数，将TCGA 数据库中535 例KIRC 患者分为PHF6高表达组和PHF6低表达组，采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank 检验，比较两组患者的OS、PFS、DSS。

1.2 基因本位（Gene Ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

为探究PHF6调节KIRC 的可能的分子机制，依据PHF6表达水平的中位数，将TCGA 数据库中535 例KIRC 患者分为PHF6高表达组和PHF6低表达组，利用R 语言的“Limma”包对两组患者的所有基因进行差异分析，并将|Log Fold Change|＞1 作为共同差异基因。采用DAVID 在线数据库（https://david.ncifcrf.gov）对上述共同差异基因进行GO 分析，并将共同差异基因中PHF6高表达组的基因提取出来进行KEGG 通路富集分析，通过R 语言的“ggplot2”包进行可视化。

1.3 免疫组化法验证组织微阵列中相关蛋白与PHF6 表达的相关性

选取KEGG 通路富集分析中的相关基因进行相关性分析，免疫组化法验证组织微阵列中相关蛋白与PHF6 表达的相关性。选取上海超芯生物科技有限公司购买的75 例KIRC 组织及癌旁组织（共150 个矩阵），经二甲苯及梯度乙醇脱水，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）洗涤3次，在微波炉内用柠檬酸盐修复15 min，冷却至室温后，TBST 洗涤3 次，免疫组化笔圈出组织，过氧化物酶封闭15 min。滴加稀释后的山羊血清一抗，4 ℃孵育过夜，室温复温30 min，胰蛋白酶标记的羊抗鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合酶孵育1 h，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色15 min，苏木素复染15 min，1%酸性乙醇分化液分化2 s，返蓝2 min 后，梯度乙醇及二甲苯复水，封片，镜检。

判定标准：依据染色强度进行评分，无着色计1 分，浅黄色染色计2 分，黄色或深黄色染色计3分，细胞呈较深黄色且没有背景着色计4 分，细胞呈深黄色且没有背景着色计5 分；依据阳性细胞所占比例评分，＜5%计1 分，5%～24%计2 分，25%～49%计3 分，50%～75%计4 分，＞75%计5 分。将染色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘，1～4 分为阴性，5～8 分为弱阳性，9～12 分为阳性，13～25 分为强阳性；其中1～8 分为低表达，9～25 分为高表达。

1.4 统计学方法

使用R 语言和SPSS 16.0 对所有数据进行统计分析，计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。采用Kaplan-Meier 法评估PHF6高表达组与PHF6低表达组KIRC 患者的生存差异，组间比较采用Log-rank 检验；绘制ROC 曲线，计算AUC，评估PHF6表达对KIRC 的诊断价值。采用R 语言中的cor 函数计算相关系数r，验证组织微阵列中相关蛋白与PHF6 表达的相关性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常肾组织和KIRC 组织中PHF6 表达情况的比较

TCGA 数据库中，正常肾组织中PHF6的相对表达量为（2.434±0.051），明显高于KIRC 组织的（2.011±0.018），差异有统计学意义（t=8.215，P＜0.01）。TCGA 和GTEx 数据库中，正常肾组织中PHF6的相对表达量为（2.352±0.482），明显高于KIRC 组织的（2.011±0.018），差异有统计学意义（t=7.417，P＜0.01）。

2.2 TCGA 数据库中不同临床特征KIRC 患者KIRC 组织中PHF6 表达情况的比较

TCGA 数据库中，不同年龄、性别KIRC 患者KIRC 组织中PHF6表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同临床分期、组织学分级、肿瘤状态KIRC 患者KIRC 组织中PHF6表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中术后无新发肿瘤患者的PHF6高表达率高于术后新发肿瘤患者，且随临床分期、组织学分级升高，PHF6高表达率逐渐降低。（表1）

表1 TCGA 数据库中不同临床特征KIRC 患者KIRC 组织中PHF6 表达情况的比较

2.3 组织微阵列中不同临床特征KIRC 患者KIRC组织中PHF6 表达情况的比较

组织微阵列中，不同年龄、性别、组织学分级情况KIRC 患者KIRC 组织中PHF6 表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同临床分期KIRC 患者KIRC 组织中PHF6 表达情况比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 组织微阵列中不同临床特征KIRC 患者KIRC 组织中PHF6 表达情况的比较

2.4 PHF6 表达水平对KIRC 的诊断价值

ROC 曲线显示，KIRC 组织中PHF6表达水平诊断KIRC 的AUC 为0.730（95%CI：0.672～0.782），灵敏度为77.80%，特异度为58.90%。（图1）

图1 PHF6表达诊断KIRC的ROC曲线

2.5 预后情况的比较

依据PHF6表达水平的中位数，将TCGA 数据库中KIRC 患者分为PHF6高表达组和PHF6低表达组，Kaplan-Meier 法评估不同PHF6表达情况KIRC 患者生存情况的差异，结果显示，PHF6高表达组患者的中位OS、PFS、DSS 均长于PHF6低表达组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图2～图4）

图2 PHF6高表达组（n=268）与PHF6低表达组（n=267）KIRC患者的OS曲线

图3 PHF6高表达组（n=266）和PHF6低表达组（n=266）KIRC患者的PFS曲线

图4 PHF6高表达组（n=265）和PHF6低表达组（n=265）KIRC患者的DSS曲线

2.6 GO 分析和KEGG 通路富集分析

为研究PHF6参与KIRC 发生发展的可能分子机制，对TCGA 数据库中PHF6高表达组和PHF6低表达组KIRC 患者的基因进行分析，结果共筛选出750 个差异基因，其中300 个相对PHF6表达上调，450 个相对PHF6表达下调。GO 分析结果显示，差异基因的生物过程主要集中于体液免疫应答、补体激活和B 细胞介导的免疫上，细胞成分主要集中于免疫球蛋白复合物、含胶原蛋白的细胞外基质、细胞的顶端部分和血液微粒上，分子功能主要集中于抗原结合、糖胺聚糖结合和硫化合物结合上。将共同差异基因中PHF6高表达组的基因提取出来进行KEGG 通路富集分析，结果显示，PHF6高表达的KEGG 通路主要集中于胆固醇代谢、白细胞介素-17 信号通路和类固醇激素生物合成中，表明PHF6可能通过生物代谢与合成、炎症反应影响免疫调节与应答，调节KIRC 的发展进程。（图5、图6）

图5 差异基因的GO分析

图6 差异基因的KEGG富集分析

2.7 免疫组化法验证组织微阵列中相关蛋白与PHF6 表达的相关性

选取KEGG 免疫相关的信号通路中参与KIRC发生发展的基因，探讨其与PHF6表达的相关性，从而进一步推断PHF6在KIRC 中的作用。参与肿瘤调节的基因如肌醇1，4，5-三磷酸2 型受体（inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2，ITPR2）（是促进细胞衰老、减少细胞增殖的基因）、磷脂酶A2组ⅣA（phospholipase A2 group ⅣA，PLA2G4A）（是介导溶酶体损伤的基因）、前列腺素F 受体（prostaglandin F receptor，PTGFR）（是抗血管生成的基因）、核糖体蛋白S6 激酶A6（ribosomal protein S6 kinase A6，RSK4）（是抑癌基因），均与PHF6的表达呈正相关（r=0.52、0.34、0.50、0.42，P＜0.01）。表明PHF6与ITPR2、PLA2G4A、PTGFR、RSK4 在KIRC 中的作用相似，可以抑制KIRC 细胞的生长。

通过免疫组化法验证组织微阵列中RSK4 与PHF6 表达的相关性，由2 名研究者独立对染色后的组织微阵列中PHF6 蛋白和RSK4 蛋白的阳性细胞所占比例和染色强度进行综合评分，结果显示，RSK4 蛋白的表达与PHF6 蛋白的表达呈正相关（r=0.557，P＜0.01），表明PHF6 蛋白可能通过调节RSK4 蛋白的表达抑制KIRC 细胞的生长。（图7）

图7 组织微阵列中KIRC患者KIRC组织中PHF6与RSK4的表达情况（免疫组化染色，×10）

3 讨论

PHF6的表达水平对KIRC 患者的预后有重要意义。近年来，随着生物信息学技术的飞速发展，通过大数据分析某些或某类基因在疾病中的作用，可以为疾病的发生发展、治疗和预后评估等提供新思路。KIRC 与免疫微环境、肿瘤特异性遗传和表观遗传学改变有关，这些改变均可导致多个肿瘤相关基因表达水平的改变。目前，虽然已经开发了新的诊断手段提高KIRC 的诊断率，但由于KIRC 起病隐匿、肿瘤标志物较少，KIRC 患者的早期诊断效率仍较差[7]；因此，为寻找新的早期诊断和预后评估的生物标志物，本研究对TCGA 数据库中KIRC 患者的病历资料和RNA-seq 数据进行了分析。

本研究首先分析了TCGA 数据库中KIRC 患者的临床特征，结果显示，PHF6表达水平与KIRC 患者的临床分期、组织学分级、肿瘤状态有关；且与正常肾组织相比，PHF6在KIRC 组织中表达下调。然后本研究绘制ROC 曲线推断PHF6表达水平对KIRC 的诊断效能，结果显示，PHF6表达水平诊断KIRC 的AUC 为0.730（95%CI：0.672～0.782），灵敏度为77.80%，特异度为58.90%。Kaplan-Meier分析发现，PHF6高表达组患者的中位OS、PFS、DSS 均长于PHF6低表达组患者，提示PHF6的表达水平可能对KIRC 患者的预后有指示作用。

目前，临床对PHF6 如何参与KIRC 的发生发展过程仍知之甚少，为进一步研究PHF6在KIRC中的生物学功能，本研究依据PHF6 表达水平的中位数，对PHF6高表达组和PHF6低表达组KIRC 患者的差异基因进行GO 分析，结果显示，PHF6表达与体液免疫应答、B 细胞受体信号通路、抗原结合和补体激活有关，提示PHF6基因主要富集在免疫相关通路上，且可能对免疫相关通路存在促进作用；将共同差异基因中PHF6高表达组的基因提取出来进行KEGG 富集分析显示，PHF6高表达的KEGG 通路主要集中于胆固醇代谢、白细胞介素-17 信号通路和类固醇激素生物合成中，表明PHF6可能通过生物代谢与合成、炎症反应影响免疫调节与应答，调节KIRC 的发展进程。有研究证实，T细胞的衰竭是导致KIRC 组织免疫抑制的关键因素，且与患者的不良预后有关[8]。既往研究证实，ITPR2对衰老和凋亡的触发有重要贡献[14]；PLA2G4A的下调减弱了肿瘤细胞的上皮-间充质转化过程，抑制了肿瘤细胞的生长和转移[15-16]；PTGFR甲基化改变可以将转录调控重新定位到肿瘤组织，从而抑制肿瘤进展[17]；RSK4与多种肿瘤患者的生存期有关[18-19]。本研究选取上述基因与PHF6的表达水平进行相关性分析，并通过免疫组化方法验证组织微阵列中RSK4 的表达与PHF6 表达的关系，结果发现，TPR2、PLA2G4A、PTGFR和RSK4均与PHF6的表达水平呈正相关，且RSK4 蛋白的表达与PHF6 蛋白的表达呈正相关。

综上所述，与正常肾组织相比，PHF6 在KIRC组织中表达下调，PHF6 高表达KIRC 患者的预后较好，RSK4 的表达与PHF6的表达呈正相关。可以根据PHF6的表达水平，对KIRC 患者进行干预，有必要将其作为KIRC 的候选生物标志物。