细胞焦亡在新生儿缺氧缺血性脑病中的研究进展

黄润芝 曹长青 李宇宁

1.兰州大学第一临床医学院，甘肃兰州 730000；2.兰州大学第一医院儿科，甘肃兰州 730000

缺氧缺血性脑病是新生儿常见的神经系统病变之一，围生期窒息是其发病的主要原因[1]。在全球范围内，每年大约有120 万新生儿患者，是新生儿健康的重大威胁。新生儿缺氧缺血性脑病发病机制复杂，目前临床上尚无特异性治疗方法，部分患者疗效不佳，并且存在不良的临床结局，如脑瘫、癫痫、发育异常、认知功能障碍等，严重者甚至导致死亡[1]。因此，研究探索新生儿缺氧缺血性脑病发生及发展的具体机制，为该病的预防及临床治疗提供靶点显得十分重要。

细胞焦亡是近年来提出的一种全新的细胞死亡机制，它与传统的细胞凋亡、细胞自噬性死亡及细胞坏死均不同[2]。20 世纪90 年代，科学家们首次在巨噬细胞中观察到了细胞焦亡的现象[3]，然而，由于技术的限制，人们对其机制了解并不清楚。近年来，在众多科学家们的努力下[4]（我国邵峰教授在细胞焦亡领域做出了巨大贡献[5-7]），细胞焦亡的生物学过程逐渐被揭示：细胞焦亡是一种程序性细胞死亡，主要通过炎症小体介导多种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）（主要是caspase-1）的激活，进而引起GSDM 家族蛋白，特别是GSDMD 的剪切和多聚化，剪切后的GSDM 蛋白会转位至细胞膜上，造成细胞穿孔，导致细胞的肿胀和死亡[2]。

细胞焦亡是机体重要的应激及免疫调节过程，在感染性疾病[8]、代谢性疾病[9]、肿瘤[10]及神经系统疾病[11]中扮演重要角色。越来越多的证据表明细胞焦亡与新生儿缺氧缺血性脑病存在密切联系，本文主要围绕细胞焦亡与新生儿缺氧缺血性脑病的关系展开系统综述，以期为该病的临床治疗提供启示。

1 细胞焦亡信号通路

细胞焦亡现象最初由Brennan 和Cookson 发现，他们观察到伤寒沙门菌可以通过caspase-1 介导巨噬细胞死亡，该现象被命名为细胞焦亡[2]。细胞焦亡过程最显著的特点为细胞膜受损形成孔洞，细胞肿胀破裂，进而释放大量的炎症细胞因子。研究表明，焦亡过程中细胞膜孔洞的形成是由GSDM 家族蛋白介导的。当GSDM 家族成员被蛋白酶切割，释放N 端结构域后会转位至细胞膜，在胞膜上形成孔洞，导致细胞膜通透性改变、细胞肿胀和细胞死亡[2,12]。

根据GSDM 蛋白激活方式的差异，细胞焦亡分为经典细胞焦亡通路、非经典细胞焦亡通路和caspase-3 介导的细胞焦亡通路[2]。经典细胞焦亡通路由caspase-1 介导，当细胞内的炎性复合物NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）感知到病原体信号后，会激活caspase-1，促进caspase-1 对GSDMD 的切割。切割后的N-GSDMD 蛋白随后转位至细胞膜上触发细胞焦亡[13]。非经典的细胞焦亡通路由caspase-4/5/11 这3 种酶介导。在非典型细胞焦亡途径中，活化的caspase-4/5/11 切割GSDMD 形成N-GSDMD，触发细胞焦亡[14]。细胞中还存在caspase-3介导的细胞焦亡，caspase-3 是凋亡信号通路的重要环节，内源性和外源性凋亡均可以激活caspase-3。而活化的caspase-3 可以切割GSDME 生成N-GSDME，导致细胞焦亡[7]。近年来，随着细胞焦亡的具体机制被逐渐揭开，细胞焦亡逐渐成为各个领域研究的热点，人们也发现细胞焦亡在多个疾病中扮演重要作用，包括新生儿缺氧缺血性脑损伤，但是，其具体的作用机制及临床意义仍需深入探索。

2 新生儿缺氧缺血性脑病与炎症

缺氧缺血性脑损伤是新生儿死亡和长期神经功能障碍的主要原因，该病和致残率和死亡率高，疾病负担较重[15]。有确切的证据表明，神经炎症反应是新生儿缺氧缺血性脑病的关键发病机制，各种原因引起的脑组织缺氧缺血可以触发大脑中免疫细胞的强烈激活，进而触发炎症级联反应[16]。

在所有引发缺氧缺血后神经炎症的免疫细胞中，小胶质细胞扮演主要角色[17]。当受到缺氧缺血刺激后，小胶质细胞会产生并释放一系列炎症介质，如白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。研究显示，小胶质细胞激活的分子机制多样，细胞焦亡、Galectin-3信号通路、Notch 信号通路、Toll 样受体信号通路等均参与到小胶质细胞的活化和炎症因子的产生[17]。其中，细胞焦亡处于中心环节。多种上游信号均可与细胞焦亡相互作用，最终导致细胞膜孔洞的形成和炎症因子的大量释放。

因此，深入探索细胞焦亡在小胶质细胞中的激活过程，阐明细胞焦亡与新生儿缺氧缺血性脑病的关系是目前研究的热点。

3 细胞焦亡与新生儿缺氧缺血性脑病

3.1 缺氧缺血与小胶质细胞焦亡

NOD 样受体家族（NOD-like receptors，NLRs）是一种免疫系统的多蛋白复合物构成的细胞感受器，是人体内重要的炎症反应传感器和效应器之一，也是细胞焦亡通路激活的的关键环节。而NLRP3 是NLRs的家族成员之一，与凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD，ASC）和caspase-1 组成炎症小体，既往研究显示，脑组织缺氧缺血后可以检测到小胶质细胞中NLRP3 炎症小体的激活[18]。在小鼠缺氧缺血性脑损伤模型中，损伤4 h后NLRP3 表达即显著上调[19]。NLRP3 被缺氧及炎症因素激活后，会进一步募集下游蛋白激活细胞焦亡通路，造成小胶质细胞细胞穿孔、死亡和炎症的扩散。另外，NLRP3 的激活也可以调节小胶质细胞向M1 型极化状态转变，增强其促炎能力[20]。有学者在缺氧缺血性脑损伤动物模型中发现，使用红景天苷抑制小胶质细胞中NLRP3 炎症小体的激活可以显著抑制小胶质细胞焦亡和周围神经元损伤[21]。caspase-1/4/5/11 是细胞焦亡激活必不可少的蛋白酶，在脑损伤发生后，其表达量和活性会显著升高[19]，促进细胞焦亡的发生。此外，细胞焦亡的效应蛋白GSDM 和效应产物IL-1β、IL-18 的表达水平在缺氧缺血性脑损伤也显著增加[22]，这些结果提示，细胞焦亡深度参与了新生儿缺氧缺血性脑病的发生和发展。

3.2 缺氧缺血触发细胞焦亡的分子机制

细胞焦亡在新生儿缺氧缺血性脑病的致病过程中扮演关键角色，进一步明确细胞焦亡的激活过程有助于增进对于该病的理解。目前多项研究针对缺氧缺血引起小胶质细胞焦亡的分子生物学机制展开了探索。

趋化因子是细胞因子的重要成员，是人体应激及应对感染的主要细胞因子的之一。Serdar 等[23]在新生小鼠缺氧缺血模型中发现，缺氧缺血发生24 h 内，脑组织小胶质细胞中的趋化因子C-X-C 基序趋化因子配体1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）和趋化因子受体C-X-C 基序趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2，CXCR2）的转录表达即显著上调；CXCL1 的表达上调可以通过作用于趋化因子受体CXCR2 进而激活整合素链接激酶（integrin-linked kinase，ILK），ILK 可以直接作用于NLPR3激活炎症小体进而促进caspase-1 的活化[23]，最终诱导细胞焦亡的发生和炎症因子的扩散。

氧化应激是新生儿缺氧缺血性脑病的关键致病因素，研究显示，新生儿大脑由于多不饱和脂肪酸含量高、耗氧量高、游离铁含量高等特点，对缺氧缺血极为敏感，表现为强烈的氧化应激反应[24]。氧化应激反应会导致小胶质细胞产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[24]，ROS 产生后，会通过触发胞内硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）和硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）复合物的解离。随后游离的TXNIP 与NLRP3 的LRR 区域结合，最终导致NLRP3 激活和细胞焦亡的发生。同时，ROS 产生也会通过Keap1/Nrf2 通路促进NLRP3 的构象转变从而直接激活NLRP3[25]，进而介导细胞焦亡。

此外，TLR4/NF-κB 信号通路也在缺氧缺血后细胞焦亡激活的过程中扮演重要角色。TLR4 是Toll 样受体家族的核心蛋白，主要表达于小胶质细胞，在启动神经炎症反应和介导神经免疫方面发挥关键作用。当缺氧缺血发生后，TLR4 可会被内源性（如纤连蛋白、热休克蛋白等）或者外源性配体（如脂多糖）过度激活[26]，随后以沉默髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖的方式促进炎症因子的表达和NF-κB 信号通路的激活，最终转录性的活化NLRP3，触发细胞焦亡。

总之，新生儿缺氧缺血发生后触发细胞焦亡的机制多样，与趋化因子、氧化应激反应及TLR4/NF-κB均有关联，还有研究显示，丝裂原活化蛋白激酶信号通路[27]及缺氧诱导因子-1α 信号通路[28]等也参与到缺氧缺血损伤后NLRP3 炎症小体和细胞焦亡的激活。因此，细胞焦亡是新生儿缺氧缺血性脑病致损的下游信号通路和效应器，靶向细胞焦亡可以有效地减轻神经系统炎症反应，是有临床前景的治疗手段之一。

3.3 细胞焦亡与新生儿缺氧缺血性脑病的治疗

基于细胞焦亡在新生儿缺氧缺血性脑损伤中的关键作用，人们已经开发出许多靶向焦亡通路的治疗药物。

在小鼠脑缺血模型中，使用NLRP3 抑制剂MCC950[29]和Bungeanum[30]抑制小胶质细胞焦亡可以显著改善小鼠的认知功能。姜黄素治疗可以通过调节TREM2/TLR4/NF-κB 通路减少NLRP3 的激活[18]，进而减少NLRP3 依赖性细胞焦亡来改善小鼠模型的临床症状。此外，白藜芦醇[31]、黄芩素[32]、槲皮素[33]和异甘草素[34]等天然药物均被发现具有抑制NLRP3 炎症小体的作用，有望为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗带来益处。

人们还开发出一些靶向caspase 酶的治疗药物。AC-YVAD-CMK 是一种caspase-1 的选择性抑制剂，被发现可抑制小胶质细胞焦亡并在小胶质细胞中诱导抗炎表型，从而改善缺氧缺血后脑损伤的症状[35]。另一种caspase-1 的抑制剂VX765 被证实也可以显著抑制细胞焦亡和TLR4/NF-κB 信号通路，有助于减轻神经损伤[36]。芍药苷等天然药物可以通过抑制小胶质细胞中caspase-11 依赖性焦亡信号通路减弱神经炎症反应[37]。

靶向细胞焦亡的效应器GSDMD 也是一种有效的抑制焦亡手段，靶向GSDMD 的策略有两种：抑制其剪切或者抑制剪切后的N-GSDMD 蛋白。小分子药物Mafenide 通过直接结合GSDMD-Asp275 位点抑制GSDMD 的剪切[38]，进而抑制巨噬细胞和小胶质细胞焦亡。此外，小分子药物Sulfa-4 和Sulfa-22 也可以靶向GSDMD 的剪切，抑制细胞焦亡和炎症因子释放，显著减轻神经炎症的程度[39]。人们也发现，小分子药物DMF 可以作为N 端GSDMD 蛋白的有效抑制剂，降低小胶质细胞焦亡和炎症因子的释放[40]，如IL-1和IL-18 等。值得注意的是，靶向细胞焦亡的药物虽然比较多，但其基本都处于动物实验或者临床试验阶段，临床应用层面尚无与细胞焦亡有关的新生儿缺氧缺血性脑病治疗方案，相信随着研究的深入和更多药物开发手段的改进，未来必将探索出更多更为有效的抑制细胞焦亡的治疗方法，也将为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗带来曙光。

4 小结

新生儿缺氧缺血性脑病是新生儿常见的神经系统病变，也是婴幼儿死亡和致残的重要原因。多项研究显示，作为炎症激活和扩散的核心环节，细胞焦亡在新生儿缺氧缺血性脑病中扮演关键角色，靶向抑制细胞焦亡的治疗策略也显示出良好的缓解神经系统损伤的效果。此外，细胞焦亡受到多种因素的调控，如细胞凋亡、坏死性凋亡及细胞自噬等，深入研究缺氧缺血发生后细胞焦亡的激活过程和具体调控机制仍是基础研究的热点。目前，部分天然药物已被证明具有抑制细胞焦亡的效果，天然药物安全性较高，价格低廉，具有其独特优势，但其特异性不强，进一步发现特异性靶向细胞焦亡的药物将是未来研究的重点方向。相信随着细胞焦亡研究的深入，人们将加深对于新生儿缺氧缺血性脑病的理解，也将为该病的治疗带来新希望。