缺血再灌注对老年心脏的损伤机制及研究进展

信 强，崔碧红，苏秀兰，张喜鹤

（1.内蒙古医科大学,内蒙古 呼和浩特 010059；2.乌兰察布市第四医院，内蒙古 乌兰察布 012000；3.廉江市人民医院门诊输液科，广东 湛江 524400；4.内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心，内蒙古 呼和浩特 010050；5.廉江市人民医院博士工作站，广东 湛江 524400）

心肌缺血再灌注损伤是指临床手术过程中心肌组织在供血中断后以及恢复供血的同时加剧损伤并引起心脏功能障碍的现象[1]。心肌缺血再灌注损伤往往继发于冠状动脉血管成形术、心肌梗死的溶栓治疗、心脏外科体外循环等治疗过程中[2]。损伤通常由两部分组成：冠状动脉突然阻塞会导致心肌中血液的灌注量突然减少，引起心肌缺血，并触发细胞凋亡和坏死，从而导致心肌细胞死亡；另一方面，当冠状动脉突然涌入大量血液，使心肌细胞在极度缺血的状态下突然大量充血，细胞中的氧含量急速升高，激活氧化应激、Ca2+超载、炎症等途径从而诱发心肌细胞凋亡并造成缺血组织的进一步损伤。这一现象给临床治疗缺血性心肌病增加了困难，也给患者带来了进一步的伤害并影响愈后[3]。目前临床通常采取缺血预处理的方法即在手术前给予心脏多次短暂缺血/再灌注过程，减轻由缺血复灌造成的心肌组织损伤[4]。老年心肌不耐受是由多种因素共同影响的，例如随着年龄增大，心肌细胞的纤维化增加，心肌肥厚增多，由于老年心肌细胞的细胞色素C 从线粒体释放到胞质显著增加以及抗凋亡蛋白Bcl-2 含量降低而导致的心肌细胞的凋亡增多。造成上述现象的内在原因包括如老年心肌细胞胞浆内Ca2+调控能力降低，通过增加舒张期Ca2+积聚而导致肌浆网Ca2+摄取比率改变[5]。同时心肌细胞的线粒体功能受损和对氧化损伤的放大是老年心肌细胞不耐受的主要原因。本文主要对这种现象产生的原因进行深入的阐述。

1 老年心肌细胞对氧化损伤敏感

细胞内的活性氧是造成细胞缺氧/复氧损伤的主要诱因。活性氧自由基是氧代谢中的副产物，主要是线粒体由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换并且在能量代谢中产生的一类高活性分子，主要包括过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O2-）以及单线态氧等四种形式。心肌细胞在缺氧/复氧过程中过量的活性氧自由基可引起脂质过氧化、蛋白质的氧化损伤以及细胞的凋亡和坏死，从而引起心肌病变[6]。细胞内过量的活性氧自由基聚集可导致线粒体功能障碍、细胞代谢紊乱以及细胞受体信号增加等[7]。研究发现细胞内适量的活性氧自由基对局部感染有一定的抑制效果，然而随着年龄的增长，人体内活性氧自由基水平也呈增长趋势，过量的活性氧自由基会对细胞内的DNA 和蛋白及细胞膜造成损伤，进一步加速衰老[8]。人体内的抗氧化系统可降低或减少由活性氧自由基及其代谢物对机体造成的损伤，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽酶等，这其中超氧化物歧化酶起主要作用。超氧化物歧化酶在细胞的不同区域通过与金属离子结合而发挥功能，如细胞质中铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD2）、线粒体中的锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD2）以及细胞外空间的超氧化物歧化酶（ec-SOD2）[9]。而细胞质中其他的抗氧化酶主要功能是把H2O2水解成水和氧[10]。而在老年心肌的缺血再灌注时再灌注过程会产生大量的活性氧，在老年细胞本身活性氧自由基高表达、抗氧化系统功能不全的情况下，大量的活性氧突发性产生会对细胞和组织造成严重的损伤。基于上述原因，缺氧/复氧对细胞的损伤在老年人身上显得更严重[11]。

2 老年线粒体功能衰退加重缺血再灌注损伤

线粒体是具双层膜结构的细胞器，其主要功能是产生能量维持细胞的生命活动。心肌细胞因为要不断地跳动来维持其收缩和泵血功能，因此需要消耗大量的能量，而心肌细胞总体积的30%是线粒体。这也导致在缺氧/复氧过程中心脏要比其他的器官承担更重的压力以及损伤[12]。线粒体的功能衰减和细胞的衰老是相伴而生的。这表示细胞内自由基的增加会引起细胞的损伤并导致衰老的发生。这一理论后来发展为细胞内积累的自由基损伤线粒体并影响线粒体的功能。虽然针对这一理论有不同的看法和质疑，然而线粒体在衰老、疾病的发生中起的作用却得到广泛关注和验证[12]。在缺血再灌注过程中，活性氧自由基大量产生并积累，导致DNA损伤，线粒体脂质过氧化和线粒体膜的去极化，以及Ca2+稳态的破坏，这些导致细胞色素C以及凋亡蛋白酶活化因子释放到细胞质中并引起细胞死亡。研究指出，随着年龄的增长，线粒体产生的活性氧自由基显著增加，进而给细胞清除活性氧自由基增加了很大的压力，从而在缺氧/复氧时会导致更严重的细胞损伤。缺氧/复氧时经过电子传递链的氧化磷酸化被抑制导致超氧自由基积累并引起ATP 减少。另外随着年龄的增加，线粒体相关蛋白如磷酸盐、腺嘌呤核苷酸以及ATP/ADP的含量和活性也显著降低。缺氧/复氧损伤的主要原因是由于细胞凋亡，而线粒体在细胞凋亡过程中起重要调控作用。线粒体除了产生能量外，还参与了调控细胞的自噬、凋亡和坏死等。线粒体功能障碍可导致心肌细胞死亡，被认为是心肌缺血再灌注损伤的标志之一[13]。

随着年龄的增长，人体各个器官和组织的细胞不可避免的走向衰老。目前认为衰老分为复制性衰老和应激诱导性早衰两大类。线粒体的结构随着细胞的衰老也会发生明显的变化，同时功能也会减弱。研究发现与年轻细胞相比，衰老细胞的线粒体存在严重的肿胀、分裂和长度增加以及碎片化程度显著升高，线粒体内部会发生嵴断裂。细胞线粒体结构的变化和功能的减弱导致细胞能量的产生受到阻碍，这又进一步影响细胞的功能和新陈代谢[14]。线粒体功能下降如呼吸链功能失调会减少ATP 的产生，氧化还原失衡以及增加活性氧的生成，可引起老年人心肌肥厚，慢性心力衰竭以及心律失常，同时活性氧也会造成线粒体的DNA和蛋白质受损，进一步影响线粒体功能[15]。有研究发现与青年人相比，老年人的NAD+表达显著降低，而NAD+是电子传递链的辅酶，主要功能是促进ATP 的合成，同时NAD+表达水平的降低可诱导超氧化物歧化酶的表达降低，进而导致活性氧自由基浓度的升高，而在缺氧/复氧发生时活性氧自由基高表达的细胞会承受更大的压力和造成更重的损伤[16]。

细胞内的各种离子浓度对细胞的生命活动具有重要的调控意义，且不同的组织和器官中的离子浓度具有较大差异。心肌细胞中的线粒体对钠离子（Na+）、钾离子（K+）和钙离子（Ca2+）的浓度敏感，这些离子对调节心肌细胞的能量供应、信号转导以及细胞凋亡至关重要，上述过程的异常会影响心脏收缩功能甚至引起心脏病变[17]。Ca2+在心脏的收缩和舒张过程中起重要的调节作用，细胞通过调整线粒体和胞浆内的Ca2+浓度影响心肌细胞的生理活动。细胞膜上的Ca2+通道是调整钙离子浓度的主要结构，心肌细胞膜上主要钙离子通道有电压依赖性（LCa2+）、电压依赖性T 型钙离子通道（TCa2+）和NCX。心肌钙循环主要是在心肌细胞中的肌质网（SR）内进行，是心肌兴奋-收缩偶联钙循环的主要场所，为钙瞬变提供了约92%的Ca2+。LCa2+是钙内流的主要通道，也在心肌细胞正常生理兴奋-收缩偶联中起到重要作用。NCX 是非ATP 依赖的双向Ca2+转运蛋白，对Ca2+的转运依赖于细胞膜内外Na+、Ca2+浓度的变化。心肌细胞在正常情况下，通过NCX将细胞兴奋时由电压依赖性Ca2+通道进入细胞内的Ca2+排出细胞外，维持心肌细胞Ca2+稳态和收缩偶联。而在病理状态如缺氧条件下，膜上的Na+/H+交换体被激活，导致细胞内Na+浓度升高，后者又可以通过增强反向NCX使胞内Ca2+浓度超载[18]。细胞内Ca2+超载是缺血心肌再灌注过程中细胞凋亡、坏死，以及心功能降低的重要原因。在正常生理条件下，适当浓度的Ca2+进入线粒体，激活参与三羧酸循环的酶，诱导ATP 的生成。细胞浆中Ca2+浓度升高时会诱导线粒体摄取Ca2+的增加，使线粒体内超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶等的活性下降，并进一步导致氧自由基增多，使线粒体膜蛋白变性和通透性增加并造成线粒体损伤[19]；另一方面，线粒体渗透性转换孔（PTP）在Ca2+稳态、活性氧信号转导以及细胞代谢方面具有重要的生理功能。衰老、缺血再灌注损伤和癌症等都会影响线粒体渗透性转换孔的开放。线粒体渗透性转换孔有两种不同的开放模式：暂时性开放和持续性开放，暂时打开是可逆事件；而持续性打开不可逆并且会导致细胞死亡。Ca2+与活性氧浓度的升高会诱导线粒体渗透性转换孔持续性打开而导致细胞死亡和组织器官损伤[20]。

线粒体存在于所有有核细胞中，具有独立于细胞核基因组的遗传序列，可自主编码相关蛋白。线粒体DNA（mtDNA）长度为16 569 bp，是具有多拷贝的环状双链DNA 分子，共包含37 个基因，其中13个编码呼吸酶复合体的多肽，24 个基因编码转移RNA 和核糖体RNA。线粒体DNA 与细胞核基因组相比有其独特的环境和特性：比如裸露的线粒体DNA 缺乏组蛋白的保护，使其容易与致癌物结合；线粒体内氧自由基及过氧化氢等物质的浓度高，同时线粒体本身又不能有效清除这些过氧化物，因此DNA更容易受到氧化损伤；线粒体蛋白质组大约含有1 500 个蛋白，除了37 个线粒体编码的蛋白外，大部分由细胞核基因组编码，然后在细胞质内转录翻译后被转运至线粒体特定位点[21]。线粒体的结构和功能随着年龄增加而不断变化，研究发现衰老个体中线粒体DNA 相对含量增加。线粒体中蛋白通过各种通路影响线粒体的功能以及活力，如PINK1/Parkin 是细胞自噬调控蛋白，对细胞的能量供应和凋亡有重要意义，如研究发现PINK1 过表达可招募磷酸化的Parkin，诱导ATP 生成增加以及活性氧自由基生成减少而改善线粒体功能[22]。此外，线粒体也会通过自噬受体p62/ SQSTM1 和LC3 作用，驱动泛素化的线粒体通过自噬被降解。因此，抑制p62的活性可以抑制线粒体自噬以及受损线粒体的聚集[23]。此外，optiineurin（OPTN）和Drp1等基因都会调控线粒体的自噬，起到保护健康线粒体和清除受损线粒体的功能[24，25]。然而，随着年龄的增加，线粒体基因组损伤加重而导致编码的蛋白量减少以及功能缺失，同时老化的细胞及线粒体内活性氧自由基表达上调，导致蛋白活性受到影响，这些都会影响线粒体和细胞的功能和完整性。这也是老年线粒体自身功能不全的一个重要原因，进而当老年心肌细胞发生缺氧/复氧时线粒体不能提供较多的能量以及调控自噬的能力降低会诱导更严重的心肌细胞损伤。

3 缺血预处理对老年心肌细胞保护减弱

缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC），是指反复短暂的缺血和再灌注，使组织和器官适应手术时较长时间的缺血打击，提高缺血缺氧的耐受性[26]。随后发展出来的远端缺血预处理（RIPC）指对某组织或器官进行短暂的缺血再灌注，通过该器官或组织释放的信号分子激活神经系统而保护远处器官免受由缺氧/复氧所造成的伤害[27]。这一技术成本低、无明显不良反应而得到广泛关注。研究发现远端缺血预处理在健康人群中可增加术后的认知学习能力，同时也与患者良好预后具有相关性。研究发现[28]STAT3 和Akt 的磷酸化可以抑制由缺血再灌注造成的细胞凋亡，并降低活性氧自由基生成和炎症反应。也有研究指出缺血预处理对心肌的保护能力取决于对细胞和线粒体自噬的调控能力，而自噬能保护心肌免受缺血再灌注造成的损伤。也有研究表明[29]人体和细胞的衰老与自噬下调呈现正相关，自噬相关蛋白家族可以调控细胞自噬的起始和进展，如研究发现Atg5和Atg7可通过调控自噬减轻心脏相关的疾病，如心力衰竭以及心肌肥大等。许多动物和人类的体内外研究表明与年轻人相比，老年人心肌更容易受到缺血性伤害。尽管很多研究都表明缺血预处理能保护年龄较小人群的由于缺氧/复氧造成的心肌损伤，然而越来越多的研究发现缺血预处理对老年心肌的保护作用不敏感甚至不起作用。如一系列在老年小鼠和大鼠等小动物的体内实验表明缺血预处理不能减小由于缺氧/复氧造成的心肌梗死面积，与不做处理组相比也不会增强心肌的收缩功能，这些研究表明缺血预处理的保护作用对老年心肌不再有效[30]。

4 老年人血管功能减弱

如前所述，缺血再灌注时活性氧自由基（ROS）的爆发性生成和异常蓄积，以及心脏微循环系统受到破坏是造成心肌损伤的关键因素。微循环内皮细胞是组织和血液之间的重要屏障，同时这些细胞对缺氧缺血高度敏感。心肌微血管内皮细胞的功能决定了心肌组织的完整性并直接影响其供氧功能[31]。而在发生缺血再灌注时，微循环结构被打破，进而形成微血栓，同时出现血管收缩/舒张功能障碍以及氧自由基爆发，进而会导致血栓周围的组织和心肌细胞发生凋亡和坏死，造成周围心肌组织的梗死面积扩大。而老年心肌微血管的功能不全以及血管弹性减弱会进一步加大对微循环内皮细胞的损伤，并进一步造成心肌组织的损伤[32]。心肌细胞是永久细胞，其再生潜力有限，通过干细胞移植对心血管疾病进行治疗是目前心血管疾病研究的热点之一。为了提高干细胞疗法的效果，增强干细胞在缺血再灌注损伤后产生的炎性和纤维化环境中的生存能力是必要的。分泌型卷曲相关蛋白2（sFRP2）能够改善人间充质干细胞（hMSCs）在氧化应激下的生存能力，提高干细胞移植的治疗效果，同时又不影响hMSC 的细胞形态、表面标志物表达以及分化潜能。其作用机制可能是sFRP2 加强了Wnt/β-catenin信号，进而提高细胞存活率。

5 总结

心肌缺血再灌注损伤是临床手术对心肌造成损伤的主要原因。目前普遍认为心肌缺血再灌注损伤有4种形式：（1）微血管阻塞；（2）心肌顿抑；（3）再灌注诱发的心律失常；（4）致死性心肌再灌注损伤。同时衰老会导致细胞和线粒体功能衰退，导致组织的老化并诱发各种心血管疾病。随着人口老龄化的加剧，衰老及相关疾病将变成一个重要的公共问题，尤其老年人细胞和组织活力低以及功能不全，对损伤的抵抗和修复能力差，不但在缺血再灌注过程中受到的损伤更大，而且损伤造成的并发症更严重。临床上通过缺血预处理、后处理及药物预处理等可以减少对器官的损伤。上述方法在老年心肌的保护作用并未得到证实。随着对心肌缺血再灌注损伤机制的深入研究，亟待找到可有效预防老年心肌缺血再灌注损伤的方法来减少缺血再灌注对老年器官的损伤及改善患者的预后。