NF-κB含量与小鼠肝脏脂肪变性、血清ALT水平的关系研究

胡立业 黄碧娇 张炜 邵海华

摘 要 目的：分析核转录因子-κB（NF-κB）与小鼠肝脏脂肪变性、血清谷丙转氨酶（ALT）水平的关系。方法：将20只小鼠随机分为非酒精性脂肪肝组（高脂饮食饲养）和对照组（正常饲养），各10例。分别在10周、14周时测定ALT水平和NF-κB含量，观察两组肝组织病理形态。结果：非酒精性脂肪肝组干预10、14周时肝组织内NF-κB含量、血清ALT水平、白介素（IL）-6、IL-1β水平均高于对照组（P<0.05）。NF-κB含量与血清ALT水平呈正相关性（P<0.05）。结论：NF-κB含量增高，可导致小鼠肝脏脂肪变性，且与血清ALT水平呈正相关性。

关键词 NF-κB 非酒精性脂肪肝 ALT 肝脏脂肪变性

中图分类号：R589.2； R362 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2023）11-0056-03

引用本文 胡立业， 黄碧娇， 张炜， 等. NF-κB含量与小鼠肝脏脂肪变性、血清ALT水平的关系研究[J]. 上海医药， 2023， 44（11）： 56-58； 66.

基金项目：江西省中医药科研项目（2019B077）

The relationship between NF-κB content and liver steatosis and serum ALT level in mice

HU Liye， HUANG Bijiao， ZHANG Wei， SHAO Haihua

（Department of Pharmacy， the Hospital affiliated to Jinggangshan University， Jian 343000， China）

ABSTRACT Objective： To analyze the relationship between nuclear transcription factor-κB （NF-κB） and liver steatosis and serum alanine aminotransferase （ALT） level in mice. Methods： Twenty mice were randomly divided into a non-alcoholic fatty liver group （fed on a high-fat diet） and a control group （fed on a normal diet）， with 10 cases each. Serum ALT levels and NF-κB content were determined at 10 and 14 weeks， and pathological morphology of liver tissues was observed in the two groups. Results： The content of NF-κB in liver tissue， the serum ALT， interleukin-6， and IL-1β levels determined at 10 and 14 weeks of intervention in the non-alcoholic fatty liver group were all higher than those in the control group （P<0.05）. There was a positive correlation between NF-κB content and serum ALT level （P<0.05）. Conclusion： The increase of NF-κB content can lead to steatosis in the liver of mice and has a positive correlation with serum ALT level.

KEY WORDS NF-κB； non-alcoholic steatohepatitis； ALT； hepatic steatosis

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）是危害全球人类健康的常见慢性肝脏疾病，其病理特征是非酒精性因素导致肝细胞内脂肪变性，是诸多代谢性疾病的危险因素[1]。若干预不及时，随着疾病的不断进展，可逐渐发展至脂肪性肝炎、肝纤维化以及肝癌，威胁到患者的生命安全[2]。核转录因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）主要分布在脂肪组织中，参与了多种基因的转录，调控多种细胞因子、黏附分子及趋化因子的表达，并与脂肪代谢过程、炎症反应密切相关[3]。谷丙转氨酶（alanine aminotransferase， ALT）主要分布在肝细胞胞浆内，正常时仅有少量释放入血，在病毒性肝炎急性期或肝细胞坏死时，ALT大量释放入血，是诊断肝脏疾病的重要标志物[4]。因此，明确NAFL的发病机制，提高临床治疗特异性显得极其重要。本研究拟在小鼠模型中分析NF-κB含量与小鼠肝脏脂肪变性、血清ALT水平的關系，旨在为临床病理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

20只雄性小鼠（C57BL/6），4周龄，SPF级，购于北京维尚利德公司，并在动物中心清洁级屏障系统饲养（井冈山大学医学部实验室提供），体质量12～16 g。饲养环境：（20±2）℃、空气湿度（50±5）%，自由进食，昼夜均衡。

1.2 仪器和试剂

Avanti J-30I型高速低温离心机（Beckman Coulter公司）； DR-200B参比式8通道酶联免疫检测仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）；BS620全自动生化分析仪（深圳迈瑞公司）；胎牛血清（AusGenex P1Y LTD，批号FBS500-S）；RPMI-1640培养基（Gibco公司）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体（上海博谷生物科技有限公司）；酶联试剂盒及配套试剂均购自武汉博士德生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 分组及建模

将20只雄性小鼠随机分为对照组（n=10），给予普通饮食正常喂养；NAFL组（n=10），高脂饮食喂养，建立非NAFL小鼠模型，高脂饮食配比：胆固醇占2%、胆酸钠占0.5%、蔗糖占5%、丙硫氧嘧啶占0.2%、猪油占10%、基础饲料占82.3%。两组小鼠均自由饮水。在喂养后10、14周分别处死小鼠各5只，处死前经股动脉采集血液，取出肝脏组织，置于﹣80 ℃冰箱内保存。

1.3.2 肝组织病理检查

留取的肝脏组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光学显微镜下观察切片病理形态。轻、中、重度脂肪肝分级分别为低倍镜下见肝脏细胞脂肪变性范围占肝小叶的1/3、1/3～2/3、2/3以上。

1.3.3 NF-κB测定

取肝脏组织100 mg，剪碎，添加苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液1 mL，冰上匀浆几秒后，12 000 r/min离心10 min。留取上层清液，应用双抗体夹心法，按照试剂说明书[5]操作。在孵育过程中注意避光，用酶联免疫检测仪于波长450 nm测定OD值，并计算NF-κB含量。

1.3.4 血清ALT水平测定

小鼠处死前，禁食不禁水，无抗凝真空采血管采集股动脉血液，常温下于3 000 r/min离心10 min分离血清，置入﹣80 ℃冰箱内保存待检，采用全自动生化分析仪测定血清ALT水平。

1.3.5 血清炎症水平测定

将分离的血清用ELISA测定小鼠血清白介素-6（IL-6）、IL-1b表达，采用双抗夹心法，严格按照说明书操作，步骤同NF-κB含量检测方法。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件，计量资料用x±s表示，采取t检验；计数资料以百分比率（%）表示，采取χ2检验。采用Pearson相关法分析两指标之间的相关性。P<0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝组织病理

整个实验过程中，小鼠饮食饮水正常，皮肤完整，大便成形，精神活跃。对照组小鼠肝小叶结构完整、肝索排列整齐，肝细胞无肿胀、无异常，无炎性细胞浸润及肝脏脂肪变性。NAFL组，干预10周时的小鼠肝脏脂肪变性明显，占全部视野的50%以上；干预14周时肝脏脂肪变性占全部视野的80%以上，肝脏细胞均变大、变圆，部分肝脏细胞内见巨大脂肪滴、炎性细胞浸润。

2.2 NF-κB含量

NAFL组干预10、14周时，肝组织内NF-κB含量（n=5）随着时间延长而增加，且高于对照组（P<0.05，图1）。

2.3 血清ALT水平

NAFL组干预10、14周时检测，结果显示，血清ALT水平随着时间延长而增加，且高于对照组（P<0.05，表1）。

2.4 血清炎症水平

NAFL组干预10、14周时，血清IL-6、IL-1b水平均高于对照组（P<0.05，表2）。

2.5 相关性分析

经Pearson相关法分析，NF-κB含量与血清ALT水平呈正相关性（r=0.826，P<0.05）。

3 讨论

NAFL发病机制尚未明确，多认为是因各种原因导致脂质代谢紊乱，肝细胞内大量脂肪沉积，导致肝脏脂肪变性，造成肝脏炎症坏死或肝脏纤维化[6]。本研究发现非酒精性脂肪肝主要病理特点是肝脏细胞脂肪变性，肝脏细胞内见炎性细胞浸润。故证实了脂肪沉积、脂质代谢紊乱是致NAFL发生的主要原因，由于脂肪组织是细胞因子的重要来源，肝脏细胞脂肪变性会导致巨噬细胞浸润，促进多种炎性細胞因子的释放，以此加重肝脏组织脂肪变性程度[7]。

有研究表明NAFL的发生、发展与“多重打击”学说中的氧化应激、炎症反应、脂质过氧化等多种病理机制有关[8]。其中NF-κB是细胞内重要的核转录因子，它参与了机体的炎症反应、免疫应答，能调节细胞凋亡、应激反应。本研究结果表明模型小鼠建立后，随着高脂饮食时间的延长，使NF-κB含量明显增加，NF-κB含量越高，肝脏组织损伤越严重，且血清ALT水平越高。熊建团等[9]研究发现，TLR4/NF-κB信号通路直接在非酒精性脂肪性肝病的形成过程中发挥重要作用，且NF-κB含量明显升高，说明NF-κB信号通路参与了肝脏病变的发生、进展过程。主要原因是NF-κB是一种被炎症因子与反应性氧介导物激活的转录因子，当NF-κB活化过度，会增加脂质过氧化产物的沉积，促使大量炎症因子释放，加剧巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞活性，继而加重肝脏炎症反应，另外大量炎症介质反作用于NF-κB，进一步增加NF-κB活性，两者循环加剧，最终导致肝脏纤维化，诱发肝脏病理状态[10-11]。

基于NF-κB信号通路与炎症因子之间的关系，本研究显示，非酒精性脂肪肝组的炎症反应明显升高。许俊等[12]研究发现，IL-18通过激活NF-κB通路调控各种炎症因子而诱发胆汁淤积。董文娟等[13]研究指出，降脂瘦身汤通过下调NF-κB活性而能降低非酒精性脂肪肝大鼠的血脂水平，从而减轻肝脏病理损伤，说明NF-κB激活会释放大量的炎症因子，使体内血清炎症表达升高。分析原因可能是NF-κB信号通路通过调节各种炎性因子影响肝脏纤维化，其异常激活会导致机体免疫、炎症等相关基因表达异常，激活炎症反应会加重肝脏组织损伤；同时通过组织损伤暴露的大量内源性TLR4配体而诱导TLR4表达及活化，加剧脂肪代谢及胰岛素抵抗，使肝脏组织损伤加重，使血清ALT水平升高。

综合本研究发现，NF-κB活性增强与小鼠肝脏脂肪变性密切相关：NF-κB活性升高，肝组织损害越明显，证实NF-κB在肝脏组织脂肪变性中起着重要作用。其作用机制可能是NF-κB的过度激活诱发机体炎症反应，加剧脂肪代谢及胰岛素抵抗，从而导致肝脏组织损伤加重。但肝脏脂肪变性过程复杂，且研究缺少对NF-κB信号通路的靶向基因研究，通过对NF-κB信号通路的靶向治疗，能否延缓肝脏脂肪变性有待进一步研究证实。

参考文献

[1] 黄华清， 向爱民， 赖大行， 等. 利拉鲁肽对2型糖尿病非酒精性脂肪肝的治疗作用及可能机制研究[J]. 江西医药， 2020， 55（4）： 382-385； 389.

[2] Manne V， Handa P， Kowdley KV. Pathophysiology of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J]. Clin Liver Dis， 2018， 22（1）： 23-37.

[3] 胡波， 徐颖， 丁辉， 等. 葛根素通过抑制IκBα/NF-κB p65信号轴缓解大鼠非酒精性脂肪肝损伤[J]. 广州中医药大学学报， 2021， 38（2）： 366-372.

[4] 桑梦珠， 吴克俭， 李平静， 等. 非酒精性脂肪肝患者的ALT水平及其影响因素和应用价值分析[J]. 医学研究杂志， 2021， 50（4）： 99-105.

[5] 杨清武. 一种以酶联免疫方式检测核转录因子活性的方法： 中国， CN1477399A[P]. 2004.

[6] Anania C， Perla FM， Olivero F， et al. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Gastroenterol， 2018， 24（19）： 2083-2094.

[7] 倪斌， 易成， 张理科. 基于抗炎及抗氧化作用探讨微生态制剂在非酒精性脂肪肝模型大鼠中的应用价值[J]. 中国微生态学杂志， 2020， 32（5）： 533-536.

[8] Wang Q， Ou Y， Hu G， et al. Naringenin attenuates nonalcoholic fatty liver disease by down-regulating the NLRP3/ NF-κB pathway in mice[J]. Br J Pharmacol， 2020， 177（8）： 1806-1821.

[9] 熊建團， 顾铃毓， 王青青， 等. TLR4/NF-κB信号通路对CBS+/-小鼠非酒精性脂肪性肝病的影响[J]. 中国病理生理杂志， 2021， 37（7）： 1227-1232.

[10] 姜云， 吴大强， 马克龙， 等. 丹皮酚对非酒精性脂肪肝大鼠炎症因子表达的影响[J]. 中药新药与临床药理， 2019， 30（2）： 189-193.

[11] 何峰， 张雪莲， 温祥臣. 山楂酸对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型小鼠炎症反应及氧化应激的影响[J]. 中国药房， 2019， 30（7）： 901-905.

[12] 许俊， 刘少志， 王颖， 等. IL-18通过NF-κB通路调控MRP3对ANIT引起的胆汁淤积模型的影响及其机制[J].现代消化及介入诊疗， 2020， 25（5）： 613-617； 623.

[13] 董文娟， 杨立宏， 张文佳. 降脂瘦身汤对非酒精性脂肪肝大鼠脂代谢及核转录因子-κB蛋白表达影响的实验研究[J]. 陕西中医， 2021， 42（8）： 1016-1019.