膈下逐瘀汤对非酒精性脂肪肝大鼠脂质代谢和血小板活化的影响

朱晓松　方涛　陈文慧　谭丽萍　石安华

[摘要] 目的 研究膈下逐瘀湯对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠的治疗作用及机制。 方法 雄性SD大鼠按完全随机分组原则分为空白组、模型组和药物干预组。空白组基础饲料喂养，其余高脂饲料喂养，持续喂养12周。8周末药物干预组开始给药，动态观察各组大鼠肝组织病理变化，检测各组大鼠肝指数、血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT），肝组织TG和TC含量，以及血小板聚集率和可溶性P-选择素（CD62p）的含量。 结果 8周末模型组HE染色的肝组织病理切片观察到脂肪变性的肝细胞占肝小叶的比例>1/3，证明造模成功，12周末模型组大鼠各项检测指标与空白组比较含量均有不同程度升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，药物干预组大鼠各项检测指标含量均有不同程度降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 膈下逐瘀汤对于改善NAFLD大鼠肝细胞脂质沉积有着显著的疗效，作用机制可能与调节脂质代谢、减少CD62p的表达、降低血小板聚集率有关。

[关键词] 膈下逐瘀汤；非酒精性脂肪肝；血小板；可溶性P-选择素

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0004-04

Effects of Gexia Zhuyu Decoction on lipid metabolism and platelet activation in rats with non-alcoholic fatty liver disease

ZHU Xiaosong FANG Tao CHEN Wenhui TAN Liping SHI Anhua

Basic Medical College， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Yunnan Province， Kunming 650500， China

[Abstract] Objective To study the effects and mechanism of Gexia Zhuyu Decoction in rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods Male Sprague Dawley （SD） rats were randomized completely into three groups： blank group， model group and drug group. Blank group was fed with common diet， the others were fed with high-fat diet for 12 weeks. At the 8th weekend， the drug group was given Gexia Zhuyu Decoction. The pathological changes of hepatic tissue in rats of all groups were observed dynamically. The liver index， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， alanine aminotransferase （ALT） in serum， TC， TG in liver specimens， and platelet aggregation， soluble P-selectin （CD62p） were measured. Results At the end of 8th weekend， the pathological section of hepatic tissue by HE staining in model group showed that， the proportion of hepatic cells with fatty degeneration accounted for hepatic lobule was over 1/3， which proved that， the model was successful. At the end of 12th weekend， all indexes of model group were higher than those in blank group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. All indexes of drug group were lower than those in model group， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Gexia Zhuyu Decoction can improve the condition of liver fatty degeneration of rats with fatty liver obviously. The mechanism may be associated with the regulation of lipid metabolism， reduction of the CD62p， inhibition of platelet aggregation.

[Key words] Gexia Zhuyu Decoction； Non-alcoholic fatty liver disease； Platelet； Soluble P-selectin

非酒精性脂肪肝（NAFLD）为我国常见的慢性肝病之一，是指除酗酒原因外引起的以肝细胞内脂质过度沉积为主要病理变化的临床综合征[1]。现代分子病理学研究认为其发病跟胰岛素抵抗、氧化应激及遗传等因素有关[2]。目前治疗仍以运动、减轻体重为主，尚无理想药物[3]。中医学研究认为NAFLD的基本病机是痰瘀互结，治疗原则以活血化瘀、健脾祛痰为主[4]。应用活血化瘀方治疗NAFLD的作用机制还未研究透彻。本研究通过喂食大鼠高脂饲料，建立早期NAFLD大鼠模型，观察膈下逐瘀汤对NAFLD大鼠模型的作用，并从血小板活化的角度探索活血化瘀药物膈下逐瘀汤治疗NAFLD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级4周龄雄性SD大鼠120只，体重80～100 g，昆明医科大学动物中心提供，许可证号：SCXK（滇）2011-0004。

1.1.2 实验药品 膈下逐瘀汤（处方组成：五灵脂、当归、川芎、桃仁、丹皮、赤芍、乌药、玄胡索、甘草、香附、红花、枳壳，比例：9∶9∶6∶9∶6∶6∶6∶3∶9∶3∶9∶5）。制备成含生药量1.44 g/mL的药液[5]，4℃冰箱密封保存备用。

1.1.3 仪器试剂 Spectra Max 340PC酶标仪（美国分子仪器公司）；LBY-NJ血小板聚集仪（北京普利生仪器公司）。血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）；可溶性P-选择素（CD62p）检测试剂盒（苏州卡尔文生物技术有限公司）。

1.2 模型建立及分组给药

适应性饲养3 d后编号，按完全随机原则分为3组，空白组50只，模型组50只，药物干预组20只。空白组喂饲基础饲料，其余组给予自制高脂饲料（基础饲料88%，猪油10%，胆固醇2%），自由饮水。于4、6、8周末分别处死空白组和模型组大鼠各10只，取血和肝组织样本，动态观察造模情况，发现8周末，脂肪变性的肝细胞占肝小叶比例>1/3，为轻度脂肪肝[6-7]，因此从8周末药物干预组每天灌胃膈下逐瘀汤[7.2 g/（kg·d）]，空白组和模型组灌胃等体积生理盐水，连续给药4周，饲料不变，第10、12周分别处死各组大鼠10只。

1.3 樣本采集

实验动物禁食不禁饮12 h，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，分离血清、血浆。取血后，处死大鼠，迅速取肝组织称重，计算肝指数（肝指数=肝湿重/体重×100%）。取肝左叶组织10%甲醛固定，做病理组织学检查，肝右叶制备组织匀浆检测肝脂。

1.4 观察指标

①肝组织病理学检查；②全自动生化仪检测血清TC、TG、ALT，肝组织TG和TC含量；③按照试剂盒说明书用血小板聚集仪检测血小板聚集率；④按照试剂盒说明书采用酶标仪检测CD62p。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，样本符合正态分布且方差齐性时，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较时方差齐用LSD检验，方差不齐采用多个样本比较的秩和检验（Kruskal-Wallis）法及两两比较的秩和检验（Wilcoxon）法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

空白组大鼠毛发整洁有光泽，行动灵活，饮食饮水正常，大便正常，体重稳定增长。模型组大鼠毛色暗淡，行动迟缓，8周后食量逐渐减少，大便黏软，部分出现便溏现象。药物干预组毛发趋于空白组，活动较多，大便较正常。

2.2 肝组织病理学变化

HE染色镜下观察（图1，封三）：空白组大鼠肝细胞内未发现明显脂肪空泡，肝小叶结构完整，肝索排列整齐；模型组大鼠大量肝细胞内有脂肪空泡，脂肪变性的肝细胞数目占肝小叶比例>2/3，少量肝细胞发生气球样变，并伴有肝细胞点状坏死；药物干预组可见部分肝细胞内有较小的脂肪空泡，脂变细胞数目不到肝小叶的1/3，无细胞坏死。苏丹Ⅲ染色镜下观察（图2，封三）：空白组大鼠肝细胞未见明显红色脂滴，模型组大鼠肝细胞内红色脂滴广泛分布，药物干预组肝细胞红色脂滴明显减少。

2.3 肝指数、血脂、肝脂及血清ALT的变化

与空白组比较，模型组大鼠肝指数，血清TC、TG、ALT和肝组织TC、TG含量均升高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；与模型组比较，药物干预组大鼠肝指数，血清TC、TG、ALT和肝组织TC、TG含量均降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

2.4 血小板聚集率的变化

与空白组比较，模型组大鼠血小板聚集率第4周后升高，差异有统计学意义（P < 0.05），第8周后升高更明显，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，药物干预组大鼠血小板聚集率显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.5 血浆CD62p含量

与空白组比较，模型组与药物干预组大鼠血浆CD62p含量均显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与模型组比较，药物干预组大鼠血浆CD62p含量显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。

3 讨论

本研究采用改良高脂饲料复制NAFLD大鼠模型，由于造模时间较长，若使用成年大鼠在12周末实验结束时大鼠重量太重不适合实验，因此采用4周龄的幼鼠作为实验对象。第8周末肝组织切片HE染色观察到模型组大鼠肝小叶内超过1/3的肝细胞有脂肪空泡，为轻度脂肪肝，第12周末有超过2/3的肝细胞内有脂肪空泡，有的空泡融合将细胞核挤到一侧，有的甚至发生气球样变，可见点状坏死灶，为中重度脂肪肝，证明NAFLD模型成立[6-7]。

膈下逐瘀汤选自王清任《医林改错》，方中当归、川芎、赤芍养血活血；桃仁、红花、灵脂破血逐瘀；配香附、乌药、枳壳、元胡行气止痛，是中医活血化瘀的经典方[8]。课题组前期研究[9-11]发现，含生药量为1.44 g/mL的药液药效最为显著，因此本研究采用了该浓度的药液。12周末空白组大鼠肝细胞脂肪变性不明显，几乎看不到脂肪空泡；药物干预组大鼠肝细胞变性较模型组轻微，变性细胞数目较少，表明膈下逐瘀汤可以减轻模型大鼠肝细胞脂肪变性的程度。由于造模所选择的动物、方法、造模时间等因素的差异，未能找到本研究TC、TG、ALT准确的参考范围，但跟课题组前期研究[10-11]的数据进行比较，数值还是较接近的。本研究还进行了实验组间的比较，与空白组比较，模型组大鼠血清TC、TG和肝组织TC、TG含量均有不同程度的升高；与模型组比较，药物干预组大鼠血清TC、TG和肝组织TC、TG含量均有不同程度降低，表明膈下逐瘀汤能够降低NAFLD模型大鼠血脂和肝脂的水平，表明其不仅可以抑制脂质的吸收，还能促进肝脏对脂质的降解代谢。与空白组比较，模型组大鼠血清ALT含量明显升高（P < 0.01），表明模型大鼠有较严重的肝细胞损伤；与模型组比较，药物干预组大鼠血清ALT含量显著降低（P < 0.01），表明膈下逐瘀汤可以减轻肝损伤，有保肝护肝的功效。

传统中医学中没有NAFLD的病名，根据临床表现将其归属于“瘀证”“肝痞”“黄疸”等范畴，其病机为气滞血瘀、痰瘀互结[12-13]。“血瘀”在NAFLD的发生发展中起到重要的作用[14]。通过对“血瘀证”的研究发现，其本质是血液循环障碍，血流速度变慢，血栓形成[15]。长期高脂饮食容易导致血脂升高，血液黏稠度增加，流动性降低，血小板聚集性增加，血管内皮受损，容易形成血栓，也就是出现了血瘀证的表现[16]。不难看出，血小板活化是血瘀證发生和发展的重要病理生理基础，为解释血瘀证的病机提供了分子水平的客观依据[17]。血小板活化分子表达增加，血小板的聚集性会增强，血栓形成的可能性就增加，机体就越容易出现血瘀证[18]。

CD62p是一种位于血小板特殊颗粒和血管内皮细胞Weibel-Palade小体内的膜糖蛋白，当血小板受刺激时快速大量地表达于血小板膜表面，介导血小板和血管内皮与炎细胞黏附以及血小板之间的黏附，进而促进纤维蛋白沉积和血栓形成，是目前发现的最能反映血小板活化程度的特异性指标之一[19-20]。血小板聚集率是中医血瘀证量化标准之一，血小板聚集率越高越容易形成瘀血和血栓。

与空白组比较，从第4周造模开始，血小板聚集率就开始升高，第8周末升高更明显（P < 0.01），同时血浆CD62p含量也显著升高（P < 0.01），表明CD62p表达增多，血小板活化，血小板聚集率升高，加重微循环障碍，从而引起脂质代谢障碍，容易发生脂肪肝。与模型组比较，药物干预组大鼠的血小板聚集率和血浆CD62p含量明显下降（P < 0.01），表明膈下逐瘀汤可以减少CD62p的表达和血小板活化，降低模型大鼠的血小板聚集率，改善血流状态，促进微循环物质交换，降低肝细胞脂肪变性的概率，从而减轻NAFLD的症状。本研究结果表明，以活血化瘀为主的膈下逐瘀汤减轻NAFLD大鼠模型肝脂肪变性程度和肝损伤，降低血脂、肝脂含量，可能是通过减少CD62p的表达来抑制血小板活化、降低血小板聚集率、改善血流状态、促进肝脏脂质代谢来实现的。本研究以方验证，初步揭示了NAFLD与血瘀证的关系，为临床形成更为有效的治法方药提供理论依据和实验研究基础。

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（收稿日期：2016-08-07 本文編辑：张瑜杰）