降脂宁提取物对血管钙化的影响及其机制

陈慧敏　刘思齐　左风云　杨英

[摘要] 目的 研究降脂寧提取物对血管钙化的影响及其可能的机制。 方法 将三月龄雄性Wistar大鼠40只依据随机数字表法分为对照组、高脂钙化组、降脂宁组、阿托伐他汀组和复药组（降脂宁+阿托伐他汀），每组8只。15周后取血检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）；取胸和腹主动脉分别测定血管钙、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量及碱性磷酸酶（ALP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性；同时，各组大鼠取胸主动脉用TUNEL法测定细胞凋亡率，用Western blot检测caspase-3蛋白表达水平。 结果 与对照组比较，高脂钙化组血清TG和TC含量均明显升高（P < 0.01）；阿托伐他汀组及复药组血清TG、TC和LDL，降脂宁组血清TC均明显低于高脂钙化组（P < 0.01）；复药组血清LDL明显低于对照组、高脂钙化组和降脂宁组（P < 0.01）。与对照组比较，高脂钙化组血管钙含量和ALP活性明显升高（P < 0.05或P < 0.01）；与高脂钙化组比较，降脂宁组血管钙含量和ALP活性明显降低（P < 0.05或P < 0.01），复药组血管ALP活性明显降低（P < 0.01）。与对照组比较，高脂钙化组血管MDA含量明显升高（P < 0.01），而复药组明显低于其他四组（P < 0.01）；与对照组比较，高脂钙化组血管NO含量明显降低（P < 0.01）。与对照组比较，高脂钙化组血管平滑肌细胞凋亡率明显升高（P < 0.01）；各给药组血管平滑肌细胞凋亡率均明显低于高脂钙化组（P < 0.01）。与对照组比较，高脂钙化组血管caspase-3灰度比明显升高（P < 0.01）；各给药组血管caspase-3灰度比明显低于高脂钙化组（P < 0.01）。 结论 降脂宁提取物和阿托伐他汀均有明确的降脂疗效，而两药结合降低LDL的效果尤为明显，其作用可能与抗氧化作用有关；降脂宁组和复药组均能降低血管钙含量和ALP活性，具有一定的抑制血管钙化作用，其作用可能与其抑制血管平滑肌细胞凋亡和下调caspase-3的表达水平有关。

[关键词] 降脂宁提取物；阿托伐他汀；血管钙化；凋亡；抗氧化

[中图分类号] R331 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0025-04

Effects and mechanism of Jiangzhining extract on vascular calcification

CHEN Huimin LIU Siqi ZUO Fengyun YANG Ying

Department of Physiology， Basic School of Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Huhhot 010110， China

[Abstract] Objective To study the effects and mechanism of Jiangzhining extract on vascular calcification. Methods Three months old male Wistar rats （n=40） were divided into control group， high-fat calcification group， Jiangzhining group， Atorvastatin group and mixture group （Jiangzhining plus Atorvastatin） by using random number table method， each group was 8 rats . After 15 weeks， the levels of serum total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， high-density lipoprotein （HDL） and low density lipoprotein （LDL） were detected， the contents of vascular calcium， malondialdehyde （MDA） and nitric oxide （NO） were observed and activity of alkaline phosphatase （ALP） and superoxide dismutase （SOD） were measured on the chest and abdomen aorta. The apoptosis rates of the vascular smoothmuscle cells were observed via in situ apoptosis detection （TUNEL） and the protein expression level of caspase-3 was detected by Western blot. Results Compared with control group， the levels of TG and TC in high-fat calcification group were significantly increased （P < 0.01）. The levels of serum TG， TC and LDL in Atorvastatin group and mixture group were significantly lower than those in high-fat calcification group， level of serum TC in Jiangzhining group was significantly lower than that in high-fat calcification group （P < 0.01）. The level of serum LDL in mixture group was significantly lower than those in control group， high-fat calcification group and Jiangzhining group （P < 0.01）. Compared with control group， vascular calcium content and ALP activity in high-fat calcification group were increased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with high-fat calcification group， vascular calcium content and ALP activity in Jiangzhining group were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， ALP activity in mixture group was decreased significantly （P < 0.01）. Compared with control group， MDA level in high-fat calcification group was increased significantly （P < 0.01）， MDA content in mixture group was obviously lower than those in other four groups （P < 0.01）. Compared with control group， NO content in high-fat calcification group was decreased significantly （P < 0.01）. Compared with control group， the apoptosis rate of thoracic aorta cell in high-fat calcification group was increased significantly （P < 0.01）. The apoptosis rates of thoracic aorta cells in all drug-treated groups were significantly lower than that in high-fat calcification group （P < 0.01）. Compared with control group， gamma ratio of vascular caspase-3 in high-fat calcification group was increased significantly （P < 0.01）. Gamma ratios of vascular caspase-3 in all drug-treated groups were significantly lower than that in high-fat calcification group （P < 0.01）. Conclusion Jiangzhining extract and Atorvastatin can decrease lipid level， and the effect is increased， particular in level LDL， after two drugs alliance treatment， the effect may be related with the antioxidant function. Jiangzhining group and mixture group can inhibit vascular calcification， which may be related to decline vascular calcium content and ALP activity， the effect may be related to its inhibition of vascular smooth muscle cell apoptosis and down regulation of caspase-3 expression.

[Key words] Jiangzhining extract； Atorvastatin； Vascular calcification； Apoptosis； Anti-oxidation

血管钙化常发生于动脉粥样硬化性血管病变，也存在于糖尿病、慢性肾病、高血压等疾病的病理过程中，是导致心脑血管疾病高死亡率的重要因素[1]。以往认为，血管钙化是钙盐在血管壁的被动沉积，然而近年来许多研究结果显示，血管钙化是一个主动的、可调节的过程，与骨形成过程有相似之处[2]。因此，如何主动对血管钙化进行干预，降低其风险，成为亟待解决的问题。由于血管钙化的发生与骨形成过程有相似之处，因此用于治疗骨质疏松的药物可能会干扰血管壁的钙磷代谢；而用于治疗心血管疾病的药物又有可能对骨组织代谢产生影响，这在很大程度上使血管钙化的治疗处于两难境地，难以找到有效防治途径[3-4]。降脂宁提取物由何首乌、山楂、荷叶、决明子四味中药组方提取，具有调脂及抗动脉粥样硬化作用，阿托伐他汀具有明确的降脂作用和心血管保护作用。本研究在高脂血症合并血管钙化的大鼠模型上，利用降脂宁提取物结合阿托伐他汀共同干预，研究其对血管钙化的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3月龄雄性Wistar大鼠40只，体重（180±20）g，清洁级，由内蒙古大学实验动物中心提供。实验前，大鼠分笼饲养，自由饮水，普通饲料喂养，温度（24±2）℃，湿度（50±5）%。

1.2 实验药品与试剂

制首乌、山楂、荷叶、决明子购自北京同仁堂医药集团北城批发部。参照《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药）第十三册收载降脂宁生产工艺制备降脂宁提取物。阿托伐他汀钙胶囊由河南天方药业股份有限公司生产（20 mg/粒）。高脂饲料配方：1.2%胆固醇、10%猪油、5%蔗糖、0.2%胆酸钠、83.6%基础饲料，由北京科奥协力饲料有限公司加工。碱性磷酸酶（ALP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及一氧化氮（NO）试剂盒购自南京建成生物制品有限公司，尼古丁购自Sigma公司。TUNEL法凋亡试剂盒购自凯基生物科技发展公司（批号：KGA702），caspase抗体购自Cell Signaling公司（批号：9664）。

1.3 实验分组及动物模型制备

大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法将其分为5组，每组8只。对照组：普通饲料喂养；高脂钙化组：大鼠上午8：00给予维生素D3（300 kU/kg）肌内注射，尼古丁溶于花生油（浓度25 mg/kg）按5 mL/kg灌胃，晚上20：00给予尼古丁重复灌胃一次制备钙化模型，给予高脂饲料喂养；降脂宁组：降脂宁提取物灌胃[5 g/（kg·d）]，分兩次给药；阿托伐他汀组：阿托伐他汀钙[10 mg/（kg·d）]灌胃，1次/d；复药组：降脂宁提取物+阿托伐他汀钙灌胃；各给药组造模同高脂钙化组，高脂饲料喂养6周后开始给药，用药共8周。

1.4 取材及标本制备

各组大鼠共同喂养15周后，禁食12 h，注射过量戊巴比妥钠麻醉，股动脉取血5 mL，分离血清（-20℃贮存备用，待测各项生化指标）；开胸腹取胸腹主动脉全长，分为两部分：上胸段（约1 cm）置于中性甲醛溶液固定24 h，制成石蜡包埋块；其余部分于-80℃冰箱保存待测各项指标。

1.5 血脂检测

取血清送生化实验室检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL），采用全自动生化分析仪测定。

1.6 血管钙含量及ALP活性检测

取胸主动脉1 cm，烤干称重后进行消化，去离子水复溶，用原子吸收分光光度计在422.7 nm波长处读取吸光度，测定组织的钙含量，并换算成μmol/（mg·dw）。取腹主动脉约1 cm制备组织匀浆，吸取上清液测定血管组织ALP活性。结果用考马斯亮蓝法测定的总蛋白含量进行标准化。

1.7 血管MDA、NO含量及SOD活性检测

取腹主动脉约1 cm制备组织匀浆，3000 r/min离心15 min，吸取上清液分别测定血管组织MDA、NO含量及SOD活性。结果用考马斯亮蓝法测定的总蛋白含量进行标准化。

1.8 胸主动脉原位凋亡检测

按TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒说明书对胸主动脉石蜡切片进行细胞凋亡检测。

1.9 Western blot检测caspase-3蛋白表达

取出-80℃冰箱贮存的动脉，按试剂盒要求提取蛋白，行总蛋白定量后，取等量蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳分离后，进行转膜，封闭。免疫反应：用TBST洗膜10 min/次，3次，室温，摇动。加入合适稀释度的caspase-3一抗4℃过夜，15 mL TBST洗3次，15 mL TBS洗1次。加二抗温孵育2 h，洗涤后加入显色液孵育1 min，放入显色仪器设置参数显色5 min，凝胶图像分析系统观察，扫描胶片，进行灰度值扫描分析，灰度比=测得的caspase-3平均密度×面积/内参蛋白β-actin平均密度×面积。

1.10 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂水平比较

高脂钙化组大鼠血清TG和TC显著高于对照组（P < 0.01）；阿托伐他汀组和复药组大鼠血清TG和TC显著低于高脂钙化组（P < 0.01）；降脂宁组大鼠血清TC显著低于高脂钙化组（P < 0.01）；与对照组比较，其余四组大鼠HDL均明显降低（P < 0.05或P < 0.01）；阿托伐他汀组和复药组大鼠LDL显著低于对照组、高脂钙化组和降脂宁组（P < 0.05或P < 0.01）。

2.2 各组大鼠血管钙含量及ALP活性比较

与对照组比较，高脂钙化组大鼠血管钙含量和ALP活性明显升高（P < 0.05或P < 0.01）；与高脂钙化组比较，降脂宁组大鼠血管钙含量明显降低（P < 0.05），降脂宁组和复药组大鼠血管ALP活性均明显降低（P < 0.01）。

2.3 各组大鼠血管MDA含量、SOD活性及NO含量比较

高脂钙化组大鼠血管MDA含量明显高于对照组（P < 0.01）；复药组大鼠血管MDA含量明显低于其他四组（P < 0.01）；高脂钙化组、阿托伐他汀组和复药组大鼠血管SOD活性明显低于对照组（P < 0.05或P < 0.01）；高脂钙化组大鼠血管NO含量明显低于对照组（P < 0.01）。

2.4 各组大鼠血管平滑肌细胞凋亡率比较

应用TUNEL法检测主动脉平滑肌细胞凋亡情况，细胞核内出现棕黄色沉淀物为阳性染色。对照组大鼠血管未见阳性染色；高脂钙化组大鼠血管平滑肌见大量棕黄色沉淀物，阳性染色表达率高，细胞凋亡形态学特征明显，细胞核存在固缩和凋亡小体；降脂宁组、阿托伐汀组和复药组大鼠细胞核阳性表达弱，存在少量的凋亡小体和核固缩现象。与对照组比较，高脂钙化组大鼠血管平滑肌细胞凋亡率明显升高（P < 0.01），其余三组则明显降低（P < 0.01）；与高脂钙化组比较，降脂宁组、阿托伐汀组和复药组大鼠血管平滑肌细胞凋亡率明显降低（P < 0.01）。

2.5 各组大鼠血管caspase-3灰度比比较

与对照组比较，高脂钙化组caspase-3灰度比明显增高（P < 0.01）；与高脂钙化组比较，降脂宁组、阿托伐汀组和复药组大鼠caspase-3灰度比明显降低（P < 0.01）。

3 讨论

血管钙化的发生、发展是一个复杂的过程，常涉及多种因素，目前关于血管钙化的预防及治疗尚无明确的药物，尤其是中药干预以及中西药物结合干预的研究很少见[5-6]。

高脂血症是多种疾病的危险因素，尤其是对血管相关的病变，如动脉粥样硬化、糖尿病、肾病及高血压等，会进一步加重原发病的血管损害[7]。本研究在经典的维生素D3加尼古丁建立的血管钙化模型上结合高脂饲料喂养大鼠[8]，制备了高脂钙化模型，在该模型上给予降脂宁提取物、阿托伐他汀及两者结合的复药组进行干预，旨在观察中药降脂效果及中西药物结合治疗对高脂钙化大鼠的血脂及血管钙化的影响。

本实验研究中的降脂宁提取物由制首乌、山楂、荷叶、决明子四味中药组方提取，有研究表明，降脂宁提取物及其有效部位具有调脂及抗氧化作用[9]，而阿托伐他汀是具有明确降脂作用和心血管保護作用的他汀类药物[10]。本研究显示，降脂宁提取物和阿托伐他汀能明显降低血清TG、TC和LDL含量，而两者结合的作用比单独降脂宁提取物和阿托伐他汀更明显，尤其是降低LDL的作用，可使LDL水平降低到低于正常水平的范围。因此，中西药物结合的降脂作用明显增强。

氧化应激不仅是高脂血症血管损害的重要因素，也可以作为一个独立因素促进血管钙化的发生，氧化应激损伤通过一些细胞机制引发细胞凋亡，可能加重其心血管损害的发生[11-12]。本研究发现，与对照组比较，高脂钙化组MDA含量升高，SOD活性降低，NO含量降低，说明高脂饮食及钙化造模对血管具有明显的脂质过氧化损伤和血管内皮功能损害，而复药组能够明显地降低血管MDA含量，效果优于单独中药和西药组；各用药组也能提高血管NO含量，与对照组比较差异无统计学意义；而对SOD活性的影响则显示降脂宁组效果优于其他两个用药组。

中药对血管钙化干预作用的研究并不多见[13]，大多以单味药为主[14-17]，亦未见与西药结合进行干预。他汀类药物能够明显降低心脑血管疾病的发病率和死亡率，对血管和心脏有明显的保护功能，有研究报道其具有抑制血管钙化的作用[18]。本研究显示，降脂宁组可降低血管钙含量，效果优于其他两个用药组；降脂宁组和复药组均明显降低血管ALP活性，而阿托伐他汀组效果弱于其他两组。通过检测各组血管细胞凋亡率和caspase-3表达水平，显示各药物组的细胞凋亡率和凋亡相关基因表达水平均明显降低。因此，本研究结果提示，降脂宁提取物和阿托伐他汀对血管钙化均有一定的抑制作用，其对血管钙化的干预作用可能与抑制血管平滑肌凋亡和下调caspase-3的表达水平有关[19-20]。

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（收稿日期：2016-08-08 本文编辑：李亚聪）