溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中ERK—1、sRAGE表达研究

杨俊　曹勇　王东旭　潘迪　张营　郑长青

[摘要] 目的 探討溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中细胞外调节蛋白激酶-1（ERK-1）、人可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）的表达及意义。 方法 选取90只健康成年雄性BALB/c小鼠，根据随机数字表分为溃疡性结肠炎组（n=30）、细菌性肠炎组（n=30）及对照组（n=30），溃疡性结肠炎组给予饮用葡聚糖硫酸钠（DSS）造模，细菌性肠炎组给予大肠埃希菌菌液灌肠造模，对照组不做处理。造模成功后处死小鼠，观察各组小鼠疾病活动指数（DAI）、结肠组织病理学评分（HPS）；取小鼠结肠标本，应用免疫组化法测定ERK-1、sRAGE表达。 结果 与对照组、细菌性肠炎组相比，溃疡性结肠炎组小鼠DAI、HPS评分显著升高（P < 0.05），而细菌性肠炎组DAI、HPS评分高于对照组（P < 0.05）。溃疡性结肠炎组小鼠结肠组织中ERK-1、sRAGE阳性表达率均高于细菌性肠炎组及对照组（P < 0.05），而细菌性肠炎组小鼠结肠组织中ERK-1表达高于对照组（P < 0.05）。经Pearson相关分析显示，结肠组织中ERK-1、sRAGE与DAI、HPS评分呈正相关（P < 0.05）。 结论 结肠组织中ERK-1、sRAGE异常表达与溃疡性结肠炎的发生及病情进展有密切关系。

[关键词] 细胞外调节蛋白激酶-1；人可溶性晚期糖基化终末产物受体；溃疡性结肠炎

[中图分类号] R574.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）11（c）-0008-04

The expression of ERK-1， sRAGE in colon tissue of mice with ulcerative colitis

YANG Jun CAO Yong WANG Dongxu PAN Di ZHANG Ying ZHENG Changqing

The Second Department of Digestive Internal Medicine， Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 117004， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of extracellular signal-regulated kinase-1 （ERK-1）， human soluble advanced glycation end product receptor （sRAGE） in colon tissue of mice with ulcerative colitis. Methods 90 healthy adult male BALB/c mice were selected and divided into ulcerative colitis group （n=30）， bacterial enteritis group （n=30） and control group （n=30） according to random number table. The rats in the ulcerative colitis group were given dextran sulfate sodium sulfate （DSS）， and the bacterial enteritis group was given E. coli bacteria liquid enema modeling. The control group had no dispose. The mice disease activity index （DAI）， colonic histopathology score （HPS） of each groups after the modeling were observed. The levels of ERK-1， sRAGE expression in assay colon tissue were determined by immunohistochemistry. Results The DAI， HPS scores of the ulcerative colitis group were higher than those of the bacterial enteritis group and the control group （P < 0.05）， which of the bacterial enteritis group were higher than those of the control group （P < 0.05）. The levels of ERK-1， sRAGE expression in colonic tissues of the ulcerative colitis group were higher than those of the bacterial enteritis group and the control group （P < 0.05）， and ERK-1 expression in the colon tissue of bacterial enteritis group was higher than that of the control group （P < 0.05）. The Pearson analysis showed that the levels of ERK-1， sRAGE expression were positively correlated with DAI， HPS scores （P < 0.05）. Conclusion The abnormal expression of ERK-1 and sRAGE in colon tissue have a close relationship with the occurrence and progression of ulcerative colitis.

[Key words] Extracellular regulated protein kinase-1； Human soluble advanced glycation end product receptor； Ulcerative colitis

溃疡性结肠炎是临床上常见的胃肠疾病，目前发病机制尚不明确。已有研究表明，炎症因子、遗传背景、结肠内微生态失衡及细胞内信号传导异常等因素均可能与溃疡性结肠炎的发生及病情进展有密切的关系[1-2]。细胞外调节蛋白激酶-1（ERK-1）属于有丝分裂原激活蛋白激酶信号通路中关键信号蛋白，通过磷酸化发挥着开启及闭合信号通路的作用，从而起调控细胞因子表達的作用[3]。有研究指出，ERK-1在溃疡性结肠炎中存在明显的磷酸化现象，可活化肿瘤细胞坏死因子及转移细胞因子[4]。人可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）属于跨膜蛋白，是由晚期糖基化终末产物受体（RAGE）脱落而成，可作为慢性浸润性炎症疾病的标志物[5]。当机体组织或外周血中sRAGE水平升高则提示机体处于炎症浸润状态。本研究主要探讨ERK-1、sRAGE在溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的表达及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取90只健康成年雄性BALB/c小鼠，重量20～25 g，购于复旦大学上海医学院动物实验中心，合格证号：SCXK（沪）2014-0001。所有动物于复旦大学上海医学院动物实验中心屏障环境饲养，动物使用合格证号：SYXK（沪）2014-0008。根据随机数字表分为溃疡性结肠炎组（n=30）、细菌性肠炎组（n=30）及对照组（n=30），所有动物均行清洁级实验室饲养。

1.2 主要试剂及仪器

葡聚糖硫酸钠（DSS）购于美国Sigma公司，大肠埃希菌菌株购于上海士锋生物科技有限公司；兔抗鼠ERK-1一抗（艾美捷科技有限公司）；兔抗鼠sRAGE一抗（上海康朗生物科技有限公司）；羊抗兔二抗（南京生兴生物技术有限公司）；DAB显色剂（北京索莱宝科技有限公司）；多聚甲醛（南京新化原化学有限公司）；辣根过氧化酶[微蒙生物科技（上海）有限公司]。超声波清洗仪（型号：SKE-5S，宁波科麦仪器有限公司）；微量加样器（北京华仪三谱仪器有限责任公司）；电子分析天平（型号：BT125D，赛多利斯仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（型号UV2600，杭州康纳科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立动物模型 溃疡性结肠炎组：将5%葡聚糖硫酸钠（DSS）溶解于纯净水中，让小鼠自行服用进行造模，当小鼠持续有轻重不等的腹泻、间断血便、腹痛及全身症状，持续数周，其间可有急性发作则为建模成功；细菌性肠炎组给予大肠埃希菌菌液灌肠造模，每天灌肠1次，每次200 mL，当小鼠出现大量水样便，无脓血，无腹痛，伴有呕吐，容易发生脱水、出现电解质紊乱及酸中毒症状时则为造模成功；对照组不做处理。造模后各组小鼠持续观察12 d，第12天后处死，取出结肠组织用于相关指标检测。

1.3.2 症状体征观察及评分 建模过程中，观察各组小鼠便血、大便性状、体重变化，并参照Cooper经典评分系统[6]，将小鼠每天便血、大便性状、隐血及体重下降等评分相加，作为疾病活动指数（DAI）。

1.3.3 组织病理学炎症损伤评分 在距肛门2、6、10 cm处选取3段长约1 cm的小鼠结肠组织，石蜡包埋切片，行HE染色，采用盲法阅片，光镜下观察肠黏膜损伤情况，并根据Cooper经典组织学损伤评分法进行结肠组织病理学评分（HPS）。

1.3.4 结肠组织中ERK-1、sRAGE表达测定 造模成功后12 d随机从各组中选取10只小鼠，应用免疫组化法测定小鼠结肠组织中ERK-1、sRAGE表达水平。各组小鼠处死前24 h于腹腔内注射Brd U，共注射3次，每6小时注射1次，注射完毕12 h后应用1.5%～2.5%异氟烷吸入麻醉，然后应用脊椎脱臼法处死小鼠，取出结肠组织，应用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，行冠状位切片，切片后常温脱蜡加入3%甲醇溶液，常温下山羊血清封闭20 min，兔抗鼠ERK-1一抗、兔抗鼠sRAGE一抗，置湿盒4℃过夜，生物素标记二抗，室温下静置10 min，加入辣根过氧化酶，室温下静止10 min，滴入DAB显色剂，室温显色5～10 min，中性树脂封片。ERK-1阳性反应为细胞浆呈黄色颗粒或深黄色颗粒；sRAGE阳性反应为细胞核呈棕黄色或深黄色染色。染色深度评分：0分为无显色或显色不清，1分为浅黄色，2分为深黄色，3分为褐黄色。染色面积：0分为0%～5%，1分为>5%～35%，2分为 >35%～65%；3分为>65%。染色深度与面积之积达1～3分为“+”，4～6分为“++”，7～9分为“+++”。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠造模后表现

结肠性溃疡组小鼠成功建模后第1天，大便次数增多，出现黏液稀便；建模后第3天小鼠大便完全为稀便，部分出现为肉眼血便；造模1周后体重减轻，可见脓性血便，饮食明显减少，毛发无光泽，少食赖动。细菌性肠炎组建模后第1天，大便次数增加，为软便；建模第3天后大量水样便，无脓血，小鼠出现脱水症状。对照组小鼠无明显变化。

2.2 各组小鼠DAI、HPS评分比较

与对照组、细菌性肠炎组相比，溃疡性结肠炎组小鼠DAI、HPS评分显著升高（P < 0.05），细菌性肠炎组DAI、HPS评分显著高于对照组（P < 0.05）。

2.3 各组小鼠结肠组织中ERK-1、sRAGE阳性表达情况

溃疡性结肠炎组结肠组织中ERK-1、sRAGE阳性表达率均显著高于细菌性肠炎组及对照组（P < 0.05），而细菌性肠炎组结肠组织中ERK-1表达显著高于对照组（P < 0.05）。见表2、图2。

2.4 溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中ERK-1、sRAGE表达与DAI、HPS评分的关系

Pearson相关性分析显示，溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中ERK-1阳性表达与DAI、HPS评分呈正相关关系（r=0.332、0.328，P < 0.05）；sRAGE阳性表达与DAI、HPS评分呈正相关关系（r=0.356、0.372，P < 0.05）。

3 討论

溃疡性结肠炎是一种累及直肠及结肠黏膜组织的慢性炎症浸润性疾病，目前对于溃疡性结肠炎的发病机制尚不明确，但普遍认为与环境因素、易感基因、免疫系统及炎症因子表达异常等因素有关[7-8]。肠黏膜免疫系统中相关免疫调节因子、细胞因子可参与溃疡性结肠炎的发生及病情进展[9]。ERK-1是一类广泛分布在细胞内的蛋白激酶，是连接决定性基因表达与细胞膜表面受体间的重要信号调节酶，ERK-1信号通路在促进结肠黏膜上皮细胞增生、分化及抑制上皮细胞凋亡中起到重要的生理作用[10-12]。本研究中溃疡性结肠炎组结肠组织中ERK-1阳性表达率均高于细菌性肠炎组及对照组（P < 0.05），提示ERK-1异常表达与溃疡性结肠炎的发生有密切关系，而细菌性肠炎组结肠组织中ERK-1表达高于对照组（P < 0.05），这可能与ERK-1可活化及调控相关炎症因子从而参与肠炎的发生有关。经Pearson相关分析显示，结肠组织中ERK-1阳性表达与DAI、HPS评分呈正相关（r=0.332、0.328，P < 0.05），提示在溃疡性结肠炎中ERK-1表达水平与肠黏膜炎症损伤及临床症状有密切的关系。考虑可能机制为细胞有丝分裂刺激因子可激活ERK-1途径主要细胞外信号，被激活的ERK可通过直接、间接或核转位等方式作用于激活剂蛋白1及核因子，从而控制及调节相关炎症细胞因子表达[13-14]。

sRAGE属于内源性非酶类多配体受体，在肾系膜细胞、单核巨噬细胞、血管内皮细胞中广泛表达，它可促进多种炎症分子结合，并介导机体多种信号转导[16]。sRAGE在机体中主要作用是促进炎症发生、促进细胞因子生长、增殖及活化各种细胞因子[17]。Wang等[18]研究指出，炎症性肠炎患者结肠组织中sRAGE表达水平显著升高，其认为sRAGE在溃疡性肠炎持续损伤过程中起到重要的促进作用。本研究中溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中sRAGE阳性表达率高于细菌性肠炎及对照组，而细菌性肠炎小鼠结肠组织sRAGE阳性表达与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），提示sRAGE可能通过某种途径参与溃疡性结肠炎的发生及进展过程，同时也体现了sRAGE在溃疡性结肠炎中的独特致病机制，可以认为sRAGE只参加溃疡性结肠炎的发病过程，而与普通肠炎的发生关系不大[19]。Meijer等[20]指出，sRAGE可激活多种炎症介质表达，并诱导机体过氧化反应，从而促进炎症因子释放，介导炎性反应。本研究结肠组织中sRAGE阳性表达与DAI、HPS评分呈正相关（r=0.356、0.372，P < 0.05），进一步提示sRAGE表达异常可以影响溃疡性结肠炎炎症因子释放，并介导肠黏膜溃疡性损伤。

综上所述，结肠组织中ERK-1、sRAGE异常表达与溃疡性结肠炎的发生及病情进展有密切关系。

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（收稿日期：2016-08-20 本文編辑：程 铭）