牦牛源枯草芽孢杆菌分离培养与鉴定

叶兵兵，曹岳均，刘锐兰，吴登宇，杨创明，肖启程

（四川民族学院康巴牦牛研究中心，四川康定 626001）

随着医学的进步，人们对生物安全越来越重视，抗生素的发现大大推动了医学的进步，但滥用抗生素也带来了耐药性、超级细菌、药物残留等诸多问题。益生菌制剂作为抗生素的替代品具有较高潜力。甘孜州牦牛是高海拔地区的特有牛种，其独特的生存环境对益生菌制剂的稳定性要求较高。枯草芽孢杆菌分布较广，牛羊等食草动物的粪便中均能成功分离培养出枯草芽孢杆菌（徐淑琴等，2022 ；王国艳等，2021）。枯草芽孢杆菌益生菌制剂是一种绿色、无污染、无残留的微生物制剂（汤保贵等，2007 ；郭兴华，2002）。芽孢杆菌在生长过程中产生的多种消化酶能促进宿主胃肠道对营养物质的吸收（吴孔阳等，2020）。芽孢杆菌产生的细菌素对常见细菌有一定的抑制作用，可以增强宿主抵抗力（Khochamit 等，2015）。因此，本试验旨在利用选择培养基从牦牛粪便中分离培养出抗逆性强，稳定性好的菌种以确定牦牛源枯草芽孢杆菌使用的可行性，为甘孜州牦牛专用益生菌制剂的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设备与试剂 超净工作台（型号JJ-CJ-2F），高压灭菌锅（购自厦门致微仪器有限公司），生化培养箱（购自上海博迅实业有限公司），电泳仪（购自北京君意东方电泳设备有限公司），凝胶成像分析系统（购自北京君意东方电泳设备有限公司），高速离心机（天津广丰科技有限公司），全动内校电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司），水浴恒温振荡培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司），涡旋振荡仪等实验仪器均由四川民族学院农学院实验楼提供。

营养琼脂，营养肉汤，琼脂，可溶性淀粉琼脂，LB 琼脂（Miller），沙门氏菌生化鉴定管，枯草芽孢杆菌生化鉴定管，细菌基因组DNA 小量提取试剂盒/ 离心柱型，V-P 试剂，卢戈氏碘液，硝酸盐还原试剂（亚硝酸盐试剂），细菌基因组提取 蛋白酶K 由齐一生物科技（上海）有限公司提供。麦康凯琼脂，SS 琼脂由青岛海博生物技术有限公司提供。TS-GelRed 核酸染料Ver.2，MRS 琼脂培养基干粉，1×TAE 速溶颗粒，琼脂糖由擎科生物技术有限公司提供。通用引物由成都生工生物工程有限公司提供。

1.2 样品的采集和粗处理 新鲜牦牛粪便采自甘孜州新都桥地区放牧的牦牛，将采集的样品及时装入无菌密封袋内存放，作好编号以及标记。采样结束后用冰袋保存在保温箱运输，24 h 内送到实验室-70℃左右冷冻保存。

1.3 枯草芽孢杆菌的分离 将冰箱内冷冻保存的牦牛粪便样品称取5 g 放入装有45 mL 蒸馏水的三角瓶中，振荡混匀，小火加热三角瓶至沸腾后维持15 min。将三角瓶静置冷却，待瓶中上清液澄清后吸取0.1 mL 上清液加入装有4.5 mL 蒸馏水的试管中，配成1 ：100 浓度悬液，浓度梯度稀释102和103，分别吸取0.2 mL 涂布到MRS 培养基和可溶性淀粉培养基中（每种稀释度做3 个平行对照），将培养基置于37℃的恒温培养基倒置培养12 ～24 h 后，挑取平板上的单个、无规则、隆起、表面粗糙有褶皱的疑似菌落进行革兰氏染色镜检（谢晓佩等，2021 ；辛国芹等，2021 ；白海等，2020）。

2 枯草芽孢杆菌的鉴定

2.1 形态学鉴定 分别观察各类培养皿上的菌落形态特征，做好记录。挑取疑似枯草芽孢杆菌的单个菌落进行革兰氏染色镜检，置于油镜下观察细菌形态。

2.2 生化鉴定 使用枯草芽孢杆菌套装生化鉴定管对分离纯化后的实验菌种进行生化鉴定。

2.3 分子鉴定 使用细菌基因组DNA 提取试剂盒进行DNA 提取。

3 枯草芽孢杆菌的稳定性试验

3.1 高温耐受性试验 将待测菌液分装于洁净试管中，每管盛装10 mL 菌液，每份菌液分装4 个试管。取4 个试管中的任意3 个试管，分别置于85、90、95、100℃水浴锅中恒温水浴30 min，保留1 个试管置于室温作对照组。水浴结束后分别使用移液枪吸取200 μL 菌液在LB 营养琼脂培养基上进行涂布。涂布完成后将LB 营养琼脂培养基放置于恒温培养箱中37℃恒温培养24 h。重复上述试验3 次，计算试验菌株分别在85、90、95、100℃下的存活率。

3.2 猪胆盐试验 使用猪胆盐溶液配制浓度分别为0.03、0.1、0.2 和0.3 g/100 mL 的选择培养基各3 个，高温高压蒸汽灭菌后分别接种待测菌液，置于37℃恒温培养箱中培养24 h。计算试验菌株分别在浓度为0.03、0.1、0.2 和0.3 g/100 mL 猪胆盐溶液环境下的存活率。

4 结果与分析

4.1 枯草芽孢杆菌的形态学鉴定结果 试验发现，LB 培养基中生长出黄白色、皱襞样、不光滑菌落，符合枯草芽孢杆菌在LB 培养基上的菌落特征（见图1）。挑取符合枯草芽孢杆菌菌落特征的单个菌落，革兰氏染色为蓝色、棒状或杆状细菌（见图2）（东秀珠等，2001）。

图1 MRS 培养基上的枯草芽孢杆菌

图2 革兰氏染色为阳性

4.2 枯草芽孢杆菌的生化鉴定结果 由表1 可知，V-P 测定管、硝酸盐测定管、淀粉水解管、柠檬酸盐利用管、D-木糖发酵管、L-阿拉伯糖发酵管、甘露醇发酵管、7% 氯化钠生长管和pH 5.7 生长管结果呈阳性；丙酸盐利用管结果呈阴性。综合试验结果，初步鉴定试验菌种为枯草芽孢杆菌。

表1 生化鉴定结果

4.3 枯草芽孢杆菌的分子鉴定结果 由图3 可知，经16SrDNA 扩增后的DNA 在琼脂糖凝胶中条带大小为1500 bp 左右，与枯草芽孢杆菌PCR条带大小一致（巴翠玉等，2017）。

图3 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果

4.4 高温耐受性试验结果 由图4 可知，作用于同一温度，不同的枯草芽孢杆菌耐受程度不同；同一枯草芽孢杆菌的存活率随温度上升而降低。BS-3 在高温环境中存活率较高，高温耐受性较好。

图4 高温耐受性试验结果

4.5 猪胆盐试验结果 由图5 可知，随着猪胆盐浓度上升，枯草芽孢杆菌存活率均有所下降，在0.3 g/100 mL 猪胆盐浓度培养基的试验环境下存活率均在50%以上。

图5 猪胆盐试验结果

5 讨论

枯草芽孢杆菌作为目前益生菌制剂中提取成本与提取难度较低的一种益生菌，是目前制作益生菌制剂的不二之选。本试验从甘孜州牦牛粪便中进行菌株分离培养，并进行胆盐耐受性试验和高温耐受性试验，成功获取到稳定性较好的枯草芽孢杆菌菌株。

Fuller 等（1975）研究表明，将益生菌应用于提取源的物种时更加有效。牦牛源枯草芽孢杆菌应对牦牛腹泻性疾病更有效。

本试验最终培养出BS-1、BS-2、BS-3、BS-4，形态学鉴定及生化鉴定为枯草芽孢杆菌。

在胆盐耐受性试验中，胆盐通过降低菌体表面张力，使其细胞膜损坏或菌体直接裂解从而达到抑菌效果。试验选用加入0.03%，0.1%，0.2%，0.3% 浓度猪胆盐的培养基37℃培养24 h 左右，试验结果显示，随着猪胆盐浓度上升，枯草芽孢杆菌的存活率下降。动物体内的胆盐含量不断变化，但平均值一般为0.03%（周明等，2013），故筛选耐胆盐菌种时一般以0.3% 作为标准。在本试验中，枯草芽孢杆菌在胆盐含量0.03% 的培养基上存活率约为91.1%，浓度提高至0.3% 时存活率约为58.9%，存活率均在50% 以上，具有较好的胆盐耐受性。

在高温耐受性试验中，枯草芽孢杆菌存活率随温度升高而降低，85℃时存活率在80% 左右，但温度升高到100℃时，耐受性最好的BS-3 存活率仅为8.3%，BS-1、BS-5、BS-6 三株菌株在100 ℃的环境下无法存活。一般微生物制剂的加工温度为70 ～80℃（周明，2010），牛瘤胃的温度则为37 ～40℃。试验中，枯草芽孢杆菌在85℃高温下处理30 min 仍能保持80%左右的存活率，由此看来，枯草芽孢杆菌可以作为饲料益生菌添加入牦牛饲料中。

6 结论

从甘孜州牦牛粪便中分离出4 株枯草芽孢杆菌，经鉴定均为枯草芽孢杆菌，编号为BS-1，BS-2，BS-3，BS-4，其中BS-3 整体耐受特性最好，在4 株菌株中稳定性最高、抗逆性最强，BS-3作为枯草芽孢杆菌益生菌制剂具有较高潜力。