抑制IP3R-Ca2+途径对对乙酰氨基酚所致肝损伤及其线粒体内质网结构偶联的影响

徐王婷,宋育林

对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)因具有解热、镇痛的作用而被广泛应用于临床,但是摄入过量APAP会引起严重的肝损伤。APAP所致肝损伤的确切机制尚不明确,可能与乙酰苯醌亚胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine, NAPQI)形成、线粒体损伤、内质网应激等有关[1]。线粒体内质网结构偶联(mitochondrial-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)是线粒体和内质网之间存在的特殊的物理和生化连接区域,富集着多种蛋白质,如1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphate receptor, IP3R)、葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75,GRP75)、线粒体融合蛋白2(mitofusin 2, MFN2)等,参与内质网应激、维持钙稳态和线粒体形态、脂质合成和运输等过程[2],并与非酒精性脂肪肝等慢性肝病有关[3]。2-氨基乙氧基二苯基硼酸盐(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)是IP3R抑制剂[4],1,2-双(2-氨基苯氧基)-乙烷-N, N, N′N′-四乙酸[1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′N′-tetraacetic acid,BAPTA-AM]是公认的钙离子螯合剂[5]。为此,该研究通过观察2-APB、BAPTA-AM对APAP所致小鼠肝损伤及其肝脏超微结构、肝组织Ca2+水平、MAMs相关蛋白线粒体融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)、MFN2、IP3R1、GRP75表达的影响,探讨抑制IP3R-Ca2+途径对APAP所致肝损伤及其MAMs的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只健康的SPF级雄性C57BL/6小鼠,鼠龄7周,体质量18～22 g,购自杭州子源实验动物科技有限公司;动物许可证号:SCXK(浙)2019-0004。

1.2 试剂与仪器APAP(纯度大于99%)和BAPTA-AM(纯度大于99%)购自美国MedChemExpress公司;2-APB购自美国Sigma公司(纯度97%);丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒为罗氏诊断产品(上海) 有限公司生产;GRP75、GAPDH抗体为合肥朵能生物科技有限公司产品(货号:AB011901、AB010301);MFN1、MFN2及IP3R1抗体购自美国Signalway Antibody公司(货号:55628、33015、29549);山羊抗小鼠二抗及山羊抗兔二抗均购自美国Proteintech公司(货号:SA00001-1、SA00001-2);钙离子含量检测试剂盒及总蛋白定量测试盒购自南京建成生物工程研究所;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;Roche Cobas 8000全自动生化分析仪购自瑞士Roche公司;酶标仪产自美国Themo公司;透射电镜JEM-1400flash产自日本电子株式会社;化学发光成像分析系统ZF-670产自上海嘉鹏科技有限公司。

1.3 实验分组与处理40只小鼠随机分为正常对照组、模型组、IP3R抑制剂(2-APB)组、钙离子螯合剂(BAPTA-AM)组,每组10只。模型组、2-APB组、BAPTA-AM单次腹腔注射APAP(300 mg/kg)。注射APAP前30 min,2-APB组腹腔注射2-APB (20 mg/kg),BAPTA-AM组腹腔注射 BAPTA-AM(2.5 mg/kg)。腹腔注射APAP后,各组小鼠均禁食不禁水。APAP造模24 h后,称量小鼠体质量,麻醉后摘除小鼠眼球取血,断头处死,取出肝脏。血标本室温静置2 h,3 500 r/min离心15 min,制备血清,保存于-80 ℃冰箱中。取出肝脏后,称量肝湿重,观察肝脏外观情况,剪取部分肝左叶用4%甲醛缓冲液固定行肝脏病理学检查;取相同部位约1 mm3左右的肝组织若干块,固定于2.5%戊二醛固定液,4 ℃冷藏,用于透射电镜观察;余肝脏组织于液氮中保存,后转移至-80 ℃冰箱贮存。

1.4 肝指数根据前述所称量的小鼠处死前体质量和肝湿重计算肝指数。肝指数(%)=(肝湿重/处死前小鼠体质量) ×100%。

1.5 肝功能指标检测全自动生化分析仪检测小鼠血清ALT、AST水平。

1.6 肝组织病理观察取4%甲醛缓冲液固定的肝组织,予以脱水、石蜡包埋、切片和HE染色,光镜下观察肝组织结构。

1.7 透射电镜超微结构观察2.5%戊二醛缓冲液固定的肝脏标本,按常规透射电镜技术脱水、包埋、超薄切片、醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色,透射电镜下观察切片并采集图像进行分析。

1.8 钙离子含量测定取适量组织块,经去离子水中漂洗后,按1 ∶9 [质量(g) ∶体积(ml)]比例加入去离子水,制成10%的匀浆液,以2 500 r/min离心15 min后取上清液,采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,按照钙测试盒说明书步骤用微板法检测钙离子含量。

1.9 Western blot检测肝组织中MFN1、MFN2、GRP75、IP3R1蛋白表达取适量的肝组织,提取组织总蛋白,用BCA法进行蛋白定量后,进行SDS-PAGE电泳,再转膜、封闭,将膜依次与相对应的一抗与二抗孵育。工作浓度:GAPDH 1 ∶2 000、抗MFN1抗体 1 ∶1 000、抗MFN2抗体1 ∶1 000、抗GRP75抗体1 ∶1 000、抗IP3R1抗体1 ∶1 000、二抗1 ∶5 000。最后,ECL显影,Image J软件分析所得图像,计算目标蛋白与GAPDH的灰度值比值。

2 结果

2.1 肝指数变化模型组小鼠较正常对照组的肝湿重及肝指数均增加(P<0.01);2-APB组及BAPTA-AM组小鼠较模型组的肝湿重及肝指数均降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组小鼠肝指数变化

2.2 肝功能变化与正常对照组相比,模型组小鼠ALT、AST水平增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,2-APB组及BAPTA-AM组小鼠ALT、AST水平降低,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 各组小鼠血清ALT、AST变化

2.3 肝组织病理学改变正常对照组小鼠肝小叶结构完整,肝细胞形态正常。模型组小鼠的肝脏可见肝小叶结构紊乱,小叶中央静脉周围可见大片肝细胞坏死,并见肝窦充血及炎细胞浸润。相比于模型组,2-APB组及BAPTA-AM组小鼠肝小叶结构尚完整,可见肝细胞变性,肝细胞坏死面积均明显减少。见图1。

图1 各组小鼠肝组织病理学变化 HE×200

2.4 肝细胞超微结构变化透射电镜下,正常对照组小鼠线粒体未肿胀,线粒体嵴完整;模型组可见线粒体肿胀,线粒体嵴结构模糊、断裂、消失,内质网肿胀断裂,MAMs数量增加;2-APB组及BAPTA-AM组线粒体肿胀程度明显减轻,部分线粒体出现嵴断裂或溶解消失,内质网结构基本完整,MAMs数量减少。见图2。

图2 各组小鼠肝脏样品电镜检查结果 ×20 000

2.5 肝组织钙离子含量的变化正常对照组、模型组、2-APB组和BAPTA-AM组的小鼠肝组织钙含量分别为(0.031±0.011)、(0.066±0.029)、(0.036±0.011)和(0.040±0.016)mmol/g prot,4组间方差分析结果:F=7.476,P=0.001。与正常对照组比较,模型组小鼠肝组织匀浆中钙离子含量增加,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,2-APB组及BAPTA-AM组小鼠肝组织匀浆中钙离子含量均降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.6 肝组织MFN1、MFN2、GRP75、IP3R1蛋白表达情况与正常对照组比较,模型组小鼠肝脏的MFN1、MFN2蛋白表达均减少,而IP3R1、GRP75蛋白的表达增加(P<0.01)。与模型组比较,2-APB组及BAPTA-AM组MFN1、MFN2蛋白表达均增加,而IP3R1、GRP75蛋白的表达减少(P<0.01)。见图3。

图3 各组小鼠肝组织MFN1、MFN2、IP3R1、GRP75蛋白表达情况

3 讨论

APAP过量是急性肝衰竭的主要原因之一。肝细胞坏死是APAP所致肝损伤的早期表现[1]。既往研究[6]表明,单次腹腔注射APAP(300 mg/kg)24 h后小鼠血清ALT、AST可维持在较高水平,肝脏主要表现为小叶中心性坏死。本研究中,模型组小鼠较正常对照组的肝指数及肝湿重增加,ALT、AST水平升高,肝脏可见小叶中心性坏死,提示APAP致小鼠肝损伤模型复制成功。

有研究[7]显示,APAP肝损伤时线粒体和细胞核内钙水平升高,肝细胞内钙超载可能与瞬时受体电位M2(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)激活有关。MAMs作为线粒体与内质网之间的特殊结构,通过自身数量和(或)所富集的蛋白质的变化,发挥不同的生物学功能,如调控内质网中的Ca2+向线粒体转运,调控线粒体形态、内质网应激等[2-3]。IP3R是位于内质网膜上的Ca2+释放通道,电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)是位于线粒体外膜的Ca2+通道,而GRP75作为分子伴侣连接IP3R和VDAC1[8]。IP3R与GRP75 结合介导内质网释放Ca2+,Ca2+通过位于MAMs的复合物 IP3R-GRP75-VDAC1进入线粒体[2-3,8]。干扰GRP75可影响GRP75-IP3R的相互作用从而影响MAMs[9]。IP3R有3个亚型,分别是IP3R1、IP3R2、IP3R3,非酒精性脂肪性肝炎患者肝脏IP3R1表达上调[3]。在线粒体融合过程,MFN1或MFN2形成同型或异型复合物,促进线粒体融合、MAMs稳定和Ca2+的转运[2]。本研究显示,与正常对照组相比,模型组小鼠肝细胞线粒体嵴断裂、消失,内质网肿胀断裂;MAMs数量增加;肝脏组织中Ca2+含量较正常对照组增加;MFN1、MFN2蛋白的表达水平降低(P<0.01),IP3R1蛋白及GRP75蛋白的表达水平增加,提示IP3R-Ca2+途径的增强、MAMs及其相关蛋白表达异常参与了APAP所致的肝损伤过程。

2-APB具有多种生物活性,通过抑制IP3R和钙库操纵的钙离子内流(store-operated calcium entry,SOCE)通道降低细胞内Ca2+水平和细胞器之间Ca2+的移动[10]。2-APB可以减轻APAP所致肝损伤[4]。BAPTA-AM可通过减轻细胞内Ca2+超载起到保护细胞作用[5]。本研究显示,与模型组比较,2-APB组及BAPTA-AM组小鼠血清ALT、AST水平下降,光镜下肝脏病理变化明显改善。2-APB的作用与文献[4]报道相似。表明2-APB及BAPTA-AM均具有保护APAP所致肝损伤的作用,提示抑制IP3R-Ca2+途径可以减轻APAP所致的肝损伤。其机制可能有以下2种:① 降低肝脏Ca2+含量过载改善线粒体、内质网损伤:钙离子超载可以影响线粒体的结构和功能[11],并与APAP所致的肝损伤有关[7]。本研究显示,与模型组比较,2-APB组及BAPTA-AM组小鼠肝组织匀浆中Ca2+含量减少、肝脏线粒体及内质网病理变化减轻。提示2-APB及BAPTA-AM可通过降低肝脏Ca2+超载、改善线粒体及内质网损伤保护APAP所致的肝损伤。② 影响MAMs结构及其相关蛋白的表达:MAMs通过其自身结构和所募集蛋白的变化参与钙平衡、线粒体功能、内质网应激和细胞死亡等的调控[ 2-3]。抑制GRP75的表达可减低以VDAC1/ITPR1(IP3R1)标志的HuH7细胞MAMs数量;增强GRP75表达则作用相反[12]。文献报道,APAP中毒可导致小鼠肝脏线粒体MFN2蛋白水平下降[13];酒精性肝损伤大鼠肝脏存在线粒体功能异常和MFN2蛋白表达下调[14]。本研究显示,与模型组比较,2-APB组及BAPTA-AM组小鼠MAMs数量减少,MFN1、MFN2蛋白表达水平上调,IP3R1及GRP75蛋白表达水平降低。提示2-APB和BAPTA-AM可以通过改变MAMs数量、抑制IP3R1及GRP75和上调MFN1、MFN2蛋白表达减轻APAP所致的肝损伤,确切机制有待进一步探讨。