色氨酸-2, 3-双加氧酶2在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞和滑膜组织中的表达及意义

陈阿圆,许 媛,许和鹏,魏 伟,常 艳

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性疾病,其特征是关节肿胀、压痛和滑膜关节破坏。犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)通路为色氨酸(tryptophan, Trp)代谢的主要途径,与自身免疫病发病密切关联[1]。研究[2-3]表明,RA患者血清和关节滑液中Kyn水平升高,且与患者疾病活动性和炎症指标相关。

色氨酸2,3-双加氧酶2(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2)作为Kyn通路的主要限速酶,对Trp催化具有高度专一性。TDO2主要在肝脏和大脑中表达,本课题组前期研究[4]显示TDO2在T细胞、B细胞和巨噬细胞等免疫细胞中表达。近年来,TDO2作为神经精神疾病、癌症和自身免疫病治疗的可能性潜在靶点引起了越来越多的关注[5],但目前TDO2在RA中的表达和作用研究未见报道。本课题组前期研究表明,抑制TDO2可缓解佐剂性关节炎大鼠滑膜炎症和关节破坏[6],可能与TDO2介导成纤维样滑膜细胞异常活化有关。然而,在RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)和滑膜组织中TDO2的表达以及临床意义尚不明确。该研究采用流式细胞术和免疫荧光法检测TDO2在RA患者和健康人PBMC以及滑膜组织中的表达,对RA患者PBMC中TDO2表达与其炎症指标之间进行相关性分析,为初步探索TDO2在RA中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2021年4月—2022年4月安徽医科大学第一附属医院诊治的40例RA患者,年龄36～77(57.8±9.0)岁,男12例,女28例。RA组患者均符合2010年美国风湿病学会制定的RA诊断标准[7],并排除其他自身免疫病、肿瘤等严重性疾病。正常对照组均为健康人,共36例,年龄23～75(53.4±10.9)岁,男14例,女22例,排除存在感染、肿瘤和其他免疫性疾病。正常对照组和RA组之间年龄和性别差异均无统计学意义。收集RA组相关实验室数据类风湿因子 (rheumatoid factor, RF),C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-cyclic citrulline peptide,anti-CCP)、红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)。本课题由安徽医科大学伦理委员会批准(批准号:20210085)。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂 Ficoll-Hypaque人淋巴细胞分离液购于上海达科为生物技术有限公司,固定液(Fixation/Perm Diluent 和 Fixation/Permeabilization Concentrate)和破膜液(Permeabilization Buffer 10×)购于美国Invitrogen公司;人源TDO2-APC 流式抗体购于美国R&D公司;TDO2(15880-I-AP)抗体购于中国武汉三鹰生物技术有限公司;DAPI溶液和抗荧光衰减封片剂购自中国北京索莱宝公司;山羊抗兔IgGAF594购于中国上海Abmart医药科技有限公司。

1.2.2主要仪器 十色流式细胞仪(型号:Waters XEVO, TQ-S MS/MS)购于美国贝克曼公司;激光共聚焦显微镜(型号:Leica sp8)购于德国莱卡公司。

1.3 方法

1.3.1人PBMC的标本采集与处理 用冰盒保存EDTA抗凝管收取的正常对照组和RA组外周血样本,4 h内用Ficoll-Hypaque人淋巴细胞分离液分离提取正常对照组和RA组的PBMC。

1.3.2流式细胞术检测PBMC中TDO2表达 显微镜下观察提取的正常对照组和RA组PBMC细胞形态,调整细胞密度为2×106,重悬于100 μl磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)中。每管加入100 μl固定液,室温避光孵育15 min。用PBS洗涤后,加入破膜液95 μl,室温避光孵育10 min后,加入5 μl人源TDO2-APC流式抗体,4 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤并重悬后,过200目纱网转移至流式管中上机检测并分析TDO2表达比例和平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)。

1.3.3免疫荧光法检测滑膜组织中TDO2表达 将取得的正常对照组和RA组滑膜组织固定、包埋和切片后,进行脱蜡水化。4 ℃孵育一抗TDO2(1 ∶200)过夜。次日室温避光孵育荧光二抗(山羊抗兔IgGAF594,1 ∶200)2 h,PBS洗涤3次后,室温避光孵育DAPI 8 min。PBS洗涤3次,用抗荧光淬灭剂进行封片,激光共聚焦显微镜进行拍片。

1.3.4Image J分析滑膜组织中TDO2 MFI 在免疫荧光染色中,单通道(单色)的荧光图片每个像素的灰度值代表了该点的荧光强度大小,特定区域的荧光强度公式:平均荧光强度(mean gray value, Mean)=该区域荧光强度总和(integrated density, IntDen)/该区域面积(Area)。在Image J中打开拍摄好的图片,图片格式设置成8-bit,提取单一通道,调整图片阈值,控制每张图片的阈值在统一的范围内,并选择合适的阈值算法。设定检测参数Mean、InDen、Area,最后分析Mean值,即TDO2 MFI。

1.4 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行数据分析,结果均用Mean±SEM表示。两组数据采用独立样本t检验比较组间差异,采用Pearson和Spearman进行相关性分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TDO2在RA患者PBMC中的表达流式细胞术检测结果表明,与正常对照组相比,RA组PBMC中TDO2表达水平显著升高,TDO2 MFI与正常对照组相比,差异有统计学意义(t=-3.920,P<0.001),见图1。

图1 RA患者PBMC中TDO2的表达

2.2 TDO2在RA患者滑膜组织中的表达在RA疾病进程中,滑膜组织生理学功能被破坏,转化为增生性侵袭组织。此外,滑膜组织中成纤维样滑膜细胞功能异常和免疫细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞)浸润,导致软骨和骨骼的破坏。免疫荧光结果显示,TDO2在RA组滑膜组织中表达增加,MFI显著高于正常对照组,差异有统计学意义(t=-3.600,P<0.001),见图2。

图2 两组滑膜组织中TDO2的表达 ×630

2.3 RA患者PBMC中TDO2表达与炎症指标的关系为了研究TDO2表达与患者炎症指标之间的关系,对RA患者PBMC中TDO2表达与ESR、RF、CRP和anti-CCP之间进行了相关性分析。Pearson分析结果显示,RA组PBMC中TDO2表达与ESR呈正相关(r=0.405,P=0.045),见图3A。而Spearman分析结果显示,RA组PBMC中TDO2表达与RF、CRP和anti-CCP无显著相关性(rs=0.359,P=0.078;rs=0.093,P=0.658;rs=-0.289,P=0.162),见图3B-3D。

图3 RA患者PBMC中TDO2表达与炎症指标的相关性分析(n=25)

3 讨论

RA作为一种慢性自身免疫病,其临床表现主要为晨僵/关节痛与压痛/关节肿胀。慢性滑膜炎症作为RA的主要病理特征,在晚期治疗不足的情况下,最终形成软骨破坏和骨侵蚀,从而出现关节畸形。Kyn通路作为Trp代谢的主要代谢途径,在RA疾病进程中可能发挥重要作用。研究[8]表明,在RA患者关节滑液和尿液中Kyn水平升高,提示Kyn通路在RA患者体内代谢异常。Kyn通路在三种同工酶吲哚胺2,3双加氧酶1(indoleamine-2,3-dioxygenase1, IDO1)、IDO2和TDO2的催化下,将Trp转化生成Kyn。IDO1广泛表达于组织、器官和细胞中,除Trp外,IDO1还可催化多种含吲哚结构的底物。IDO2作为IDO1同源类似物(43%的同源性),主要表达于肾脏、大脑和附睾[9]。在RA疾病进程中,IDO1的作用存在争议,它既有促炎表现[10],也有抗炎作用[11]。IDO2在RA中的研究较少,近年来研究[12]显示在RA中具有促炎作用。

Lanz et al[13]发现在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠中,肝脏TDO2表达和活性增加,从而激活脊髓神经元的兴奋性毒性受体,致使神经变性和脱髓鞘。TDO2缺失的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠焦虑相关行为和神经变性症状减轻,表明TDO2可能参与了自身免疫病疾病进程。课题组前期研究发现,TDO2不仅在佐剂性关节炎大鼠的CD4+T细胞、B细胞和成纤维样滑膜细胞中表达增加,并且抑制TDO2的表达可抑制佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭能力[6,14],改善滑膜炎症和关节破坏,提示TDO2在RA机制中可能是一个新的关键调节因子。为进一步了解TDO2与RA之间的关系,本研究探讨了TDO2在RA患者外周血和滑膜组织中的表达以及与炎症指标是否具有相关性。

本研究从临床角度出发,检测RA患者和健康人PBMC中TDO2的表达,结果显示RA患者PBMC中TDO2表达显著高于正常对照组,提示TDO2介导的Kyn代谢通路可能参与了RA炎症免疫反应。此外,在对RA患者PBMC中TDO2表达与炎症指标相关性分析结果中发现,RA患者PBMC中TDO2表达与炎症指标ESR呈正相关。滑膜组织主要由衬里层和衬里下层组成。在RA中,成纤维样滑膜细胞功能异常致使衬里层扩张增生,大量免疫细胞如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞募集在衬里下层浸润,产生大量促炎因子,最终导致持续性滑膜炎症和软骨、骨侵蚀[15]。免疫荧光结果显示,TDO2在RA患者滑膜组织中表达增加,提示TDO2可能通过调控成纤维样滑膜细胞和免疫细胞异常活化,促进慢性滑膜炎症。

综上所述,在关节损伤过程中,TDO2可能参与了RA的病理机制,介导持续性滑膜炎症生成。TDO2介导的Kyn通路在RA中发生代谢失衡,并参与炎症免疫反应进而促进RA进展。