好氧反硝化菌Acinetobacter sp. A3生长及脱氮特性影响因素的研究

余艳鸽 甘申东 商放泽 王献昆 方嘉声

(1. 中电建生态环境集团有限公司,广东 深圳 518102;2. 东莞理工学院生态环境与建筑工程学院,广东 东莞 523808)

氮超标是引起水体黑臭、富营养化的主要原因,生物脱氮具有效率高、成本低、环境友好的优点,是最理想的脱氮方法。传统脱氮技术主要依赖硝化和反硝化微生物,他们所需反应条件不同,导致两个过程需要在不同反应器中进行,增加了反应器构造的复杂程度和运行难度。近年来,随着生物学的发展,生物脱氮技术由单纯的工艺改革向以生物学特性促进工艺改革的方向发展[1]。20世纪80年代,好氧反硝化菌引起了人们的关注[1-2]。好氧反硝化能够实现硝化和反硝化反应在同一反应器中进行,不需要提供厌氧、好氧两种反应条件,简化了生物脱氮工艺环节,有效降低装置运行成本,在生物脱氮工程应用中优势独特。这一新兴生物脱氮菌种和工艺的出现,有助于解决目前传统生物脱氮工艺中遇到的瓶颈问题[3]。

研究表明,好氧反硝化菌普遍存在于富磷河流、水库沉积物、水稻土壤、湿地等自然界中[1,2,4,5]。已报道筛选出的好氧反硝化菌主要有副球菌属(Paracoccus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)等[6]。这些菌种对高、中、低浓度氨氮废水均有较好的脱氮效果[3,7-9]。由于实际复杂环境对菌种培育成为优势菌种存在较大难度,目前好氧反硝化菌实际应用多集中在实验室小试规模。将微生物菌种固定化可有效减少环境因素的影响,提高微生物优势菌种数量和脱氮效率[10-13]。此外,好氧反硝化菌发酵条件的优化,可为固定化菌剂制备提供大量菌种。

本研究从处理黑臭水体的生物接触氧化反应器中,筛选出一株鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp. A3)的高效好氧反硝化菌种,实验结果显示该菌株可在好氧条件下显著去除黑臭水体中的总氮浓度。选取氮源、碳氮比、pH值、温度等环境因子研究分析其对该不动杆菌株生长活性及脱氮作用的影响,优化该菌株的发酵条件,为进一步推进好氧反硝化菌的实际应用奠定理论基础。

1 实验部分

1.1 实验材料

培养基配方:称量3.42 g CH3OONa,0.61 g NaNO3,0.44 g K2HPO4·3H2O,0.20 gMgSO4·7H2O,0.02 g CaCl2和0.005 g FeSO4·7H2O,以及量取0.1 mL 微量元素母液,于烧杯中,随后加入蒸馏水混匀,再移至1 L容量瓶中定容,备用。

1.2 好氧反硝化菌株来源

该好氧反硝化菌株从处理黑臭水体的生物接触氧化反应器生物膜上分离得来,经基因测序(16S rDNA)分析,鉴定为不动杆菌Acinetobacter sp. A3(简称菌株A3)。现保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC 16620。

1.3 菌株培养方法

采用上述培养基进行扩大化培养菌株A3,用接种环从斜面接种菌株A3至灭菌的含150 mL的已灭菌的反硝化培养基中, 30℃恒温,设置150 rpm/min摇床振动频率,培养至对数生长期,得到菌株A3悬液。

1.4 氮源成分对菌株A3生长及脱氮特性影响

1.5 碳氮比对菌株A3生长及脱氮特性影响

1.6 初始pH值对菌株A3生长及脱氮特性影响

1.7 温度对菌株A3生长及脱氮特性影响

1.8 分析方法

细菌生长量采用光电比浊法。当光线通过菌悬液时,由于菌体的散射及吸收作用,光线透过率降低。在一定范围内,微生物细胞浓度与光密度(简称OD值)成正比,而光密度或透光度可用光电池精确测出。光波的选择通常在400～700 nm之间,本文选用600 nm光波测定菌株A3菌悬液的OD值,以此来反映菌株A3的生长活性。

氮源、C/N、初始pH、温度等影响因素考察实验中,均采用可见光分光光度计(上海菁华,722S) 测量菌株A3菌悬液在600 nm的吸光度(简称OD600),吸光度范围是-0.301～3A。

2 实验结果与讨论

2.1 氮源环境因子的影响结果分析

2.2 碳氮比环境因子的影响结果分析

碳氮比(C/N)是影响好氧反硝化菌生长及脱氮性能最关键的环境因素之一,是反硝化过程中电子供体与受体比的度量指标。为了有效进行脱氮,需要适当剂量的碳源。如果碳含量较低,电子流就不能满足细胞生长所需的能量,从而影响细胞生长和反硝化作用。然而,如果碳含量高于最佳浓度,那么反硝化速率的增加是非常有限的[2,15]。据报道,大多数异养细菌的最佳碳氮比在8～10之间[16-18]。如图2a,本文的研究结果表明,不同C/N对菌株A3对数生长期、生长速度以及细胞最高产量均有影响。当C/N为2时,菌株A3的对数生长期仅持续了约6 h(4～10 h),在10 h后生长停滞。在对数生长期的生长速率仅为0.066 OD600/h,最大生物量为0.542 OD600。当C/N增至4时,菌株A3对数生长期的持续时间明显延长至10 h(0～10 h),生长速率为0.092 OD600/h,最大生物量提高至1.494 OD600。当C/N继续增加到10和15时,菌株A3的对数生长期延长至12 h(4～16 h),但生长速率有所减缓,分别为0.063 OD600/h和0.060 OD600/h;同时,最大生物量也分别下降为1.37 OD600和1.23 OD600。

图2 不同C/N条件下菌株A3的生长活性和浓度变化(b, c)及降解速率(d)

2.3 初始pH值环境因子的影响结果分析

图3 不同pH值条件下菌株A3的生长和NO3-N浓度变化(b, c)及降解速率(d)

2.4 温度环境因子的影响结果分析

温度是影响微生物活性的重要因子之一,低温或高温会严重抑制微生物活性,导致微生物生长缓慢[2]。大多数研究表明,好氧反硝化的有效温度在25～37℃之间的中温范围内[22-25]。从图4a可知,当温度为40℃时,菌株A3没有生长,说明该菌株不是嗜温菌[21],高温会抑制菌株的生长。当温度为20℃升高至25℃时,菌株A3快速生长。当培养温度为30～35℃之间时,菌株A3生长最快,且对总氮的降解能力最高(图4b)。这是由于温度升高,加快了硝化酶的转化活性,促进了对氮的降解[25]。因此,发酵时的培养温度宜为30～35℃。

图4 不同温度条件下菌株A3的生长(a)及浓度的变化情况(b)

3 结论

好氧反硝化技术在黑臭水体生物脱氮中具有独特优势,其核心在于特定菌株的筛选和发酵培养。本文从处理黑臭水体的生物接触氧化反应器中,筛选出具有高效好氧反硝化能力的不动杆菌株A3,探究了氮源、碳氮比、初始pH、温度等环境因子对该菌株生长活性和脱氮性能的影响。主要结论如下:

(3)菌株A3在初始pH为7～9,温度为30～35℃时生长最快。

(5)菌株A3有较强的环境适应能力,可采用该菌株制备微生物菌剂,用于污水处理设备的快速启动、水体净化等领域,有助于推进好氧反硝化菌的实际应用,具有广泛的应用前景。