不同光照条件对卷枝毛霉生长发育及类胡萝卜素合成的影响

池 铭，孙丽娟，郝浩然，马立杰，赵 婧，李鹏霞，4，张映曈*

（1.江苏省农业科学院 农业设施与装备研究所，江苏 南京 210014；2.沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳 110866；3.江苏省农业科学院 农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室，江苏 南京 210014；4.江苏省高校园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014）

类胡萝卜素属于类异戊二烯物质，是重要的天然抗氧化剂，具有延缓衰老、调剂免疫力和预防癌症等多种生理功能［1］。植物与化学合成是类胡萝卜素的传统来源，其生产效率高，受气候、光照和地理位置的影响较小，因此，食品微生物发酵生产类胡萝卜素正逐渐受到人们的关注。据报道，藻类、酵母、霉菌、细菌等多种微生物均具备合成类胡萝卜素的能力［2］。其中霉菌具有易培养、生长快、发酵条件易控制、生产成本低等优点，是微生物发酵产类胡萝卜素的理想菌株。卷枝毛霉(Mucor circinelloides)属于接合类霉菌，具有较强的类胡萝卜素合成能力，且生长速率快，拥有清晰的遗传背景和完善的分子操作体系，常被用作真菌类胡萝卜素合成的模式菌株［3］。

光照作为一种重要的环境信号，对微生物的生长昼夜节律、形态发育和生理代谢过程均起到调控作用［4］。但在不同微生物中，光照的调控作用和方式存在一定的差异。例如粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的光应答由蓝光触发，构巢曲菌(Aspergillus nidulans)在生长过程中则响应红光［5］，而白光、红光和蓝光均对灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)菌丝体的生长有促进作用［6］。在调控类胡萝卜素合成方面，蓝光、红光以及白光能分别诱导三孢布拉霉(Blakeslea trispora)［7］、杜氏盐藻(Dunaliella salina)［8］和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)［9］的类胡萝卜素合成。采用脉冲方式［7］、提高光强度［8］以及延长光照时间［9］可以进一步提高微生物的类胡萝卜素产量。因此，光质、光照强度和光照时间会在不同程度上影响微生物的生长发育和类胡萝卜素合成。

迄今，有关不同光照条件对模式菌株卷枝毛霉生长发育以及类胡萝卜素代谢影响的研究还较少。鉴于此，笔者以卷枝毛霉菌株CBS277.49为研究对象，考察了不同光质、光强和光照时间对其生长及类胡萝卜素合成的影响，明确了光照诱导CBS277.49产类胡萝卜素的最适条件，以期为微生物发酵法生产类胡萝卜素的应用奠定基础，并丰富真菌类胡萝卜素合成光诱导机制的基础理论知识。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸硫胺（生物试剂）为国药集团化学试剂有限公司产品；巯基乙醇（分析纯）为上海麦克林生化科技有限公司产品；石油醚（分析纯）为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品； RNAprep pure Plant Kit提取试剂盒由天根生化科技（北京）有限公司生产；HiScriptIII RT SuperMix for qPCR cDNA合成试剂盒由南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产。

1.2 仪器与设备

LED灯带为欧曼有限公司产品；紫外可见分光光度计（UV-1102）为上海天美科学仪器有限公司产品；PCR仪（EDC-810）为东胜国际贸易有限公司产品；CFX connect荧光定量聚合酶链式反应仪由美国Bio-Rad公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制 YPG培养基：10.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L琼脂粉、3.0 g/L酵母提取物、12.5 g/L无水葡萄糖。YNB培养基：1.5 g/L硫酸铵、1.5 g/L谷氨酸、0.5 g/L酵母氮源、10.0 g/L无水葡萄糖、20.0 g/L琼脂粉。高压灭菌后添加硫胺素和烟酸，终浓度为1.0 μg/mL。

1.3.2 菌体的培养 使用YPG培养基活化卷枝毛霉CBS277.49菌株，并在光照条件下产孢。使用无菌水冲洗平板，得到孢子液，并用血球计数板计数，调整孢子浓度为×107个/mL。

接种孢子液至YNB培养基，在（26±2）℃下培养84 h。前60 h置于黑暗条件进行培养，后24 h采用不同光质（红、绿、蓝和黑光）、不同光强（250、500、750和1000 lx）和不同光照时间（6、12、18和24 h）进行培养。定期取样，将收获的菌丝用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 类胡萝卜素产量的测定 采用紫外分光光度计法［10］测定类胡萝卜素产量(μg/g)，其计算公式为：

上式中：A453为溶液在453 nm处的吸光值；D为稀释倍数；V为提取所用石油醚体积；0.2592为消光系数；M为样品质量。

1.3.4 基因表达的测定 RNA提取按照RNAprep pure Plant Kit说明书指导完成。cDNA合成使用HiScript III RT SuperMix for qPCR cDNA合成试剂盒。以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增，并采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。每个处理重复3次。引物序列如下：actinF，TTGAACCCCAAGTCCAACCG；actinR，TGACACCATCACCGGAATCG。carRPF，GGGTCGA TGTCGTCGCTATT；carRPR，TTGAACAGGTGGAG GATCGC。carBF，AAGCAAGCTCACCTCTGACC；carBR，CAGCATCAGGCTCCTCCAAA。mcwc1-cF，CAACGACGACGCTTACAACC；mcwc1-cR，GGCCC AATTGGATCTGTGGA。

1.4 数据统计

对所有指标进行3次平行测定，最终结果采用平均值±标准误差表示。使用SPSS 22.0单因素方差分析（one-way ANOVA）进行差异显著性分析，并用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同光质对卷枝毛霉CBS277.49的影响

2.1.1 对卷枝毛霉CBS277.49菌落形态和菌丝生长的影响 由图1A可知，黑暗条件下菌落的颜色随培养时间的延长而无明显变化；培养24 h时蓝光处理的菌落颜色呈橙黄色，红光处理呈明黄色，绿光处理呈微黄色。表明蓝光照射能够显著促进卷枝毛霉CBS277.49菌落颜色的积累。

图1 不同光质对卷枝毛霉CBS277.49的菌落颜色（A）、生物量（B）和菌丝生长状态（C）的影响

由图1B可知，在培养期间所有处理的菌落生物量均呈逐步上升趋势，在培养12 h后积累速度有所减缓；不同光质处理对菌落的生物量均有显著影响，在培养6～24 h期间3个光质处理的菌落生物量均显著高于黑暗条件下的，但3个光质处理之间差异不显著。

真菌通常与植物一样具有向光性。使用不同光质单束光源侧方向照射24 h，结果如图1C所示，在绿光和蓝光照射下，菌丝均朝着光照的方向生长；而在红光照射下，菌丝的生长方向毫无规律，与黑暗条件下相仿。

2.1.2 对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素产量的影响 如图2A所示，光质处理对类胡萝卜素产量有促进效果，3个光质处理在培养6 h时的类胡萝卜素产量相当。在培养6～12 h期间，蓝光处理的类胡萝卜素产量急剧上升，并在12 h时达到峰值，为黑暗对照的22.08倍；红光与绿光处理的类胡萝卜素产量呈现小幅度上升趋势，而黑暗对照的类胡萝卜素产量无明显变化。至24 h时，3个光质处理的类胡萝卜素产量均显著下降，但蓝光处理的类胡萝卜素产量仍显著高于其他2个处理和黑暗对照的，说明蓝光照射可以显著提升CBS277.49的类胡萝卜素产量。

图2 不同光质对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素产量和合成基因表达的影响

2.1.3 对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素合成基因表达的影响 卷枝毛霉中编码八氢番茄红素脱氢酶的carB基因以及编码八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶的carRP基因负责将植物烯转化为β-胡萝卜素，是类胡萝卜素合成过程中的2个关键基因［11-12］。如图2B、图2C所示，不同光质处理对carB和carRP的表达量有不同影响。在蓝光处理下carB的表达量随着培养时间的延长而呈先上升后下降的变化趋势，在6 h时达到最高值，是对照的96.73倍，12 h时其表达量开始下降，至24 h时与黑暗对照相比无显著差异。红光和绿光处理的carB表达量在整个培养期间一直显著低于蓝光处理的。在蓝光处理下，carRP表达量的变化趋势与carB的相同，在6 h时到达峰值，且在整个培养时间内始终显著高于其他处理的。

2.2 不同光照强度对卷枝毛霉CBS277.49的影响

2.2.1 对卷枝毛霉CBS277.49菌落形态的影响 由图3A可知，不同强度的蓝光照射处理会影响CBS277.49的菌落颜色，其中在250 lx强度下培养24 h时菌落的颜色显著提升，呈现淡黄色；在500、750和1000 lx处理下培养24 h菌落的颜色均呈现橙黄色，但在1000 lx处理下菌落外圈出现了白色年轮状菌丝，说明菌丝积累胡萝卜素的能力变差。

图3 不同光强对卷枝毛霉CBS277.49的菌落颜色和类胡萝卜素产量的影响

2.2.2 对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素产量的影响 从图3B可以看出，不同强度的蓝光处理对类胡萝卜素产量有不同影响；在培养0～6 h期间各处理的类胡萝卜素产量均呈上升趋势，且在6 h时存在显著差异，光强越强，类胡萝卜素产量越高；在12 h时500、750和1000 lx处理的类胡萝卜素产量均达到峰值，分别为250 lx处理的2.90、2.94和3.25倍；在培养12～24 h期间500、750和1000 lx处理的类胡萝卜素产量均呈下降趋势，而250 lx处理则持续上升；在24 h时，蓝光1000 lx处理的类胡萝卜素产量为（1766.59±68.59）μg/g，显著高于其他3个处理的。

2.2.3 对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素合成相关基因表达的影响 如图4A和图4B所示，不同强度的蓝光处理对3个基因的表达量有不同影响。250 lx处理的carB表达量在整个培养期间变化平缓。其他3个光强处理的carB表达量随着培养时间的增加而呈先上升后下降的变化趋势，其中500 lx处理的carB表达量在培养12～24 h期间显著高于250 lx处理的，但显著低于750与1000 lx处理的（P＜0.05）。750 lx处理的carB表达量在前期显著低于1000 lx处理的，但在24 h时显著高于其他处理的。carRP表达量的变化趋势与carB相似（图4B），其中1000 lx处理的carRP表达量在6和12 h时显著高于其他处理的（P＜0.05），但在24 h时750 lx处理的carRP表达量为所有处理中最大值。

图4 不同光强对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素合成基因表达的影响

mcwc1-c基因通过编码MCWC-1C蛋白进行蓝光的感知，正向调控类胡萝卜素合成基因carB和carRP的表达［13］。由图4C可知：在整个培养期间250 lx处理的mcwc1-c表达量较低；500和750 lx处理的mcwc1-c表达量持续上升；1000 lx处理的mcwc1-c表达量在6 h时达到最高值后逐渐下降，在培养结束(24 h)时，分别仅为500和750 lx处理的0.61和0.39倍。

2.3 不同光照时间对卷枝毛霉CBS277.49的影响

2.3.1 对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素产量的影响 由图5A可知：光照6 h处理的类胡萝卜素产量较低，在6 h时达到高峰，之后开始下降且显著低于其他3个处理的；其余3个光照时间处理的类胡萝卜素产量也呈现先上升后下降的变化趋势，均在12 h时达到最高值，且相互间无显著差异；培养至24 h时，18和24 h处理的类胡萝卜素产量居前2位，且显著高于其他2个处理的。

图5 不同光照时间对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素产量和基因表达的影响

2.3.2 对卷枝毛霉CBS277.49类胡萝卜素合成相关基因表达的影响 如图5B～图BD所示，所有处理的3个基因的表达量呈先上升后下降的变化趋势；光照6 h处理的carB、carRP和mcwc1-c表达量的峰值均出现在6 h时，其余处理的峰值则均出现在12 h时；培养12 h后所有处理的carB、carRP和mcwc1-c表达量开始下降；在培养至24 h时，光照12 h处理的carB、carRP和mcwc1-c表达量最高，且显著高于其他3个处理的。

3 小结与讨论

本研究结果表明，光照可以显著促进卷枝毛霉CBS277.49的菌体生长，且该菌株具有蓝/绿光趋光性，在其他真菌中也有类似发现［14］。此外，蓝光处理加深了CBS277.49的菌体颜色，暗示其促进了类胡萝卜素的积累。测定发现蓝光照射12 h后的类胡萝卜素产量分别是绿光、红光处理和黑暗对照的2.90、2.19和22.08倍；蓝光处理的carB和carRP表达量在6和12 h时均显著高于其他处理的，说明蓝光通过上调结构基因的表达促进了类胡萝卜素的合成。这与Jing等［15］在培养基中添加醋酸盐促进carB的表达，从而提升三孢布拉霉类胡萝卜素产量的结果相似。

以蓝光为前提筛选最适光强。首先通过观察表型发现，250 lx蓝光处理的菌落颜色较淡，其余处理的菌落均为橙黄色。进一步测定类胡萝卜素产量发现，1000 lx处理的产量最高，750和500 lx处理的产量次之，说明提高光强可以促进类胡萝卜素的积累，这可能是因为类胡萝卜素产量增加可以应对强光照造成的细胞氧化损伤［16］。结构基因表达量的测定结果显示在培养前期1000 lx处理的基因表达量显著高于其他3个处理的，说明1000 lx处理通过提高carB和carRP基因的表达量促进了类胡萝卜素的合成。但随着培养时间的延长，carB和carRP的表达量均呈下降趋势，这与高光照处理三孢布拉霉后类胡萝卜素合成基因出现短暂高表达的结果［17］相似，推测与生物为保持内环境稳态而形成的一种内在“光适应”机制有关［18］。进一步研究发现在1000 lx蓝光处理下调控基因mcwc1-c的表达量在6 h时达到峰值，但随着光照时间的增加，其表达量持续下降，这进一步证实了类胡萝卜素合成在高光强下的“光适应”机制。

以蓝光1000 lx为前提进行光照时间的筛选。本结果表明：培养至18～24 h时，光照18和24 h处理的类胡萝卜素产量居前2位，且显著高于其他2个处理的；carB和mcwc1-c的表达量总体上以12～18 h光照处理较高，而carRP的表达量总体上以12 h光照处理较高；所有处理3个基因的表达量均随着培养时间的增加而呈先上升后下降的变化趋势。说明长时间光照处理后基因的表达显著下调，进而导致下游光调控基因carB和carRP的表达量显著降低。这在其他物种中也有发现，例如在集胞藻(Synechocysticsp.)PCC 6803中，长时间持续光照显著抑制了叶绿素合成相关基因的表达［19］；在糙脉孢霉中，光照2 h后wc-1基因的表达量达到峰值后显著下降，蓝光感受器WC-1蛋白的合成受到抑制，类胡萝卜素合成受阻［20］。这些结果均表明光照时间过长可能导致“光适应”，抑制下游色素的合成［21］。综合类胡萝卜素的产量以及能耗，本文最终选择18 h作为卷枝毛霉CBS277.49的最适光照时间。

综上所述，光照可以促进卷枝毛霉CBS277.49的菌体生长，其中蓝光可以显著促进类胡萝卜素结构基因的表达，进而增加类胡萝卜素的合成量。但是长时间、高光强处理会导致结构基因在短暂高表达后迅速降低，阻碍类胡萝卜素产量的进一步提升。因此，光照诱导卷枝毛霉CBS277.49菌株产类胡萝卜素的最佳条件为1000 lx蓝光持续照射18 h。