铁死亡在胰腺癌吉西他滨耐药中的研究进展

李响 田国锋 肖宛儒 郝靓

1中国医科大学法医学院化学教研室（沈阳 110122）；2辽宁省法医学生物证据重点实验室（沈阳 110122）；3中国医科大学司法鉴定中心（沈阳 110122）；4中国医科大学第一临床学院2019 级（沈阳 110000）

胰腺癌（pancreatic cancer）是一种恶性程度极高、生存率极低和预后极差的消化道肿瘤［1］，其治疗方法主要包括手术、放疗、化疗和介入治疗。胰腺癌的治疗强调综合治疗和多学科合作，根据不同患者的身体状况、肿瘤部位、侵袭范围、黄疸、肝肾、心肺功能等情况综合应用现有的诊断和治疗手段，最大限度地提高治疗效果，减少身体损伤［2］。目前，胰腺癌唯一的根治方法是手术切除。然而，由于早期缺乏特异性临床症状等原因，大多数胰腺癌患者被确诊时已进展至晚期而失去手术根治切除条件。因此，全身化疗是晚期胰腺癌主要甚至是唯一的治疗方案。胰腺癌常见的化疗方案包括改良FOLFIRINOX 方案、吉西他滨单药或5-Fu，紫杉醇联合治疗等［3］。吉西他滨是晚期胰腺癌患者化疗的一线药物，通过影响DNA 的复制过程，抑制胰腺肿瘤细胞生长增殖。然而，随着化疗药物的治疗进展，大多数胰腺癌细胞通过各种机制诱导其对化疗药物的耐药性增加，这种耐药性的增加使患者在后续吉西他滨治疗中效果显著下降，这也是晚期胰腺癌生存率进一步降低的重要原因之一，使得晚期胰腺癌的治疗受到巨大的阻碍和挑战［4-5］。近年来，改善耐药研究暂未取得令人满意的结果，究其原因在于肿瘤微环境与肿瘤干细胞的多变性、一些针对临床试验由于高毒性和血液中过量的药物剂量而失败等问题。因此，细化胰腺癌吉西他滨耐药机制和具体分子通路，寻找抑制肿瘤微环境的更好方法，探索如何改善胰腺癌细胞对吉西他滨耐药性是近年来临床研究的活跃领域。2012 年，DIXON 等［6］在实验中发现并命名了一种铁依赖型的新型细胞程序性死亡形式——铁死亡。铁死亡的调控机制也被广泛研究并应用于胰腺癌的治疗中［7-8］。BADGLEY 等［9］研究证实了诱导胰腺癌细胞铁死亡是一种可待深入探索的新型治疗手段，其可有效抑制胰腺癌细胞的生长增殖，并改善胰腺癌细胞对化疗药物的耐药。

1 吉西他滨代谢及相关耐药机制

吉西他滨是晚期胰腺癌患者化疗的一线药物，通过影响DNA 的复制过程，抑制胰腺肿瘤细胞生长增殖。然而，大多数患者在应用吉西他滨化疗数周后便表现出对吉西他滨的耐药性［10］，进而影响治疗效果和预后。因此，抑制胰腺癌患者吉西他滨耐药性进而改善预后是胰腺癌临床治疗领域的重要研究方向。

1.1 吉西他滨在细胞内代谢过程吉西他滨到达肿瘤组织后首先经人核苷转运体（human NTs，hNTs）转运进入肿瘤细胞，先后经过脱氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase，dCK）和嘧啶核苷单磷酸激酶（monophosphate kinase，NMPK）的作用被磷酸化为dFdCDP。最终在核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDPK）的作用下磷酸化为具有药物活性作用的形式——dFdCTP。dFdCTP 是脱氧胞苷三磷酸（dCTP）的竞争性底物，可以被整合入正在复制的DNA 链中，影响DNA 的复制过程，且能避免被核酸外切酶校对识别并切除。大部分的吉西他滨在细胞内被胞苷脱氨酶（cytidine deaminase，CDA）诱导脱氨失去活性，产生大量低活性产物——2＇，2＇-二氟脱氧尿苷（dFdU）［11］，见图1。

图1 吉西他滨胞内代谢过程Fig.1 Intracellular metabolism of gemcitabine

1.2 吉西他滨耐药机制从吉西他滨代谢过程中不难发现，人核苷转运体介导的药物摄取、脱氧胞苷激酶介导的细胞内代谢以及胞苷脱氨酶所介导的药物灭活是引起吉西他滨耐药的重要原因。除此之外，还有许多因素能够引发胰腺癌细胞表现出对吉西他滨的耐药性。ATP 结合盒（ABC）转运介导的药物外排被认为是胰腺癌吉西他滨耐药的最关键机制之一［12］。肿瘤微环境（TME）与肿瘤耐药密切相关，可通过招募和分泌多种保护性细胞因子增强肿瘤抗药性，也可通过构建物理屏障、影响肿瘤细胞生长代谢等介导耐药［13］。肿瘤干细胞（CSCs）是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。CSCs 导致治疗耐药的作用与激活DNA 损伤检查点修复密切相关［14］。由此可见，胰腺癌细胞通过多种方式引起吉西他滨耐药的发生，逆转耐药是晚期胰腺癌治疗的关键所在。

2 胰腺癌细胞铁死亡的调控分子机制

2012 年，DIXON 等［6］在实验中发现了铁死亡及其在细胞内的致死过程。研究表明铁死亡通过铁依赖性芬顿反应产生的脂质过氧化物（LPO）和致死性活性氧（ROS）在胰腺癌细胞内累积进而导致细胞程序性死亡。相比于“自杀”，铁死亡更像是一种“破坏”机制。细胞内铁过载后通过芬顿反应产生具有细胞毒性的脂质过氧化物，当其细胞毒作用超过了细胞内由GPX4 作为主要成分的抗氧化系统保护作用时，细胞发生铁死亡。胰腺癌细胞内铁死亡调控机制主要为以下3 条途径，System XC--GSH-GPX4 通路、铁离子代谢通路和脂质过氧化通路。见图2。

图2 铁死亡调控机制Fig.2 Regulatory mechanism of ferroptosis

2.1 System XC--GSH-GPX4通路谷氨酸/胱氨酸逆向转运体体（glutamate/cystine antiporter，System XC-）是一种镶嵌于细胞膜上的跨膜转运蛋白。System XC-能够将细胞外的胱氨酸转运到细胞内。随后，胱氨酸的二硫键在还原酶的作用下转化为巯基，进而生成半胱氨酸。半胱氨酸是合成细胞内具有抗氧化功能的主要因子谷胱甘肽（glutathione，GSH）的重要原料。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）被谷胱甘肽激活后能够发挥其清除细胞内产生的致死性活性氧（ROS），并将有毒的脂质过氧化物转化为无毒的脂质醇的重要生理功能［15-16］，进而抑制细胞铁死亡。由此可见，抑制System XC--GSH-GPX4 通路介导的抗氧化系统是改善吉西他滨耐药的可能手段。

2.2 铁离子代谢通路细胞内铁平衡是通过细胞对铁的摄取、转运和代谢维持的。转铁蛋白（TF）负载细胞外游离的Fe3+，与表达在细胞膜表面的转铁蛋白受体（TFR）结合，将Fe3+转运到细胞内。Fe3+在STEAP3（一种金属还原酶）的作用下被还原为Fe2+。当细胞内铁平衡被打破，堆积过量的Fe2+与H2O2发生芬顿反应产生大量致死性活性氧（ROS）导致细胞铁死亡［17］。有研究发现，热休克蛋白B1（HSPB1）可以通过抑制TFR1 的受体功能降低细胞内铁含量，抑制细胞铁死亡［18］。因此，调控胰腺癌细胞内的铁离子代谢过程是诱导胰腺癌细胞铁死亡的重要途径。

2.3 脂质过氧化通路YANG 等发现，脂质过氧化物（LPO），尤其是磷脂过氧化物的堆积是引起细胞铁死亡的标志性过程。在胰腺癌细胞中，多不饱和脂肪酸（PUFAs）更容易作为底物被氧化。PUFAs 经长链脂酰辅酶A 连接酶4（ACSL4）催化活化后，在溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（LPCAT3）的作用下发生酯化反应产生磷脂化多不饱和脂肪酸PUFAPLs，进而生成脂质过氧化物，引起细胞铁死亡。细胞内多不饱和脂肪酸催化氧化过程中关键酶是ACSL4 和LPCAT3［19］。这也为未来研究诱导细胞内多不饱和脂肪酸氧化进而改善吉西他滨耐药研究提供了新方向。

3 铁死亡在胰腺癌吉西他滨耐药中的研究

近年来有证据表明，铁死亡与癌症化疗耐药有关，诱导铁死亡可以逆转耐药，是肿瘤抑制的重要机制［20］。深入研究铁死亡与吉西他滨耐药发生发展的内在联系，铁死亡调控机制在改善胰腺癌吉西他滨耐药的临床应用具有重要意义。

3.1 System XC--GSH-GPX4通路与耐药溶质载体家族7 成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11/xCT）是System XC-的重要组成部分。通过向细胞内转运胱氨酸，促进细胞合成谷胱甘肽过氧化物酶4，抑制细胞发生铁死亡。TANG 等［21］研究发现，SLC7A11 在吉西他滨耐药的胰腺癌细胞中高表达。柳氮磺吡啶（SSZ）是一种SLC7A11抑制剂，它与吉西他滨联合使用可显著抑制胰腺癌细胞的生长，并且提高了胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性［22］。因此，通过抑制SLC7A11 表达，阻断GSH/GPX4 通路能够降低吉西他滨的耐药性。这一发现对胰腺癌靶向药物研发提供了新的方向。

人精脒/精胺N1 乙酰基转移酶2（Spermidine/spermineN1-Acetyltransferase2，SSAT2）是胰腺癌细胞内促生长因子低氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）降解过程中的关键酶。刘鑫鑫等［23］研究发现，在大鼠胰腺癌吉西他滨耐药细胞株中SSAT2 蛋白水平显著降低，同时铁死亡负性调控标志物GPX4 显著上调。所以促进SSAT2过表达可以降低胰腺癌细胞内GPX4 水平，从而提高胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。同时，这一现象可被Ferrostatin-1（一种铁死亡抑制剂）部分逆转。表明诱导SSAT2 过表达可以改善吉西他滨的耐药性。然而，过表达SSAT2 与耐药抑制的具体分子机制尚不明确，仍需进一步试验证实。诱导SSAT2 过表达为研究胰腺癌细胞铁死亡调控与改善耐药拓展了新方向。

NRF2 是一种致癌转录因子，其功能是调节在癌细胞中产生GSH 的细胞抗氧化系统。有研究数据显示，大部分癌细胞内存在NRF2 过表达，这与抗癌药物治疗效果差和癌症患者预后生存期低相关。细胞中NRF2 的水平与铁死亡的敏感性密切相关。NRF2 的表达增加可以抑制细胞对铁死亡的敏感性，而NRF2 的表达减少可以增强癌细胞对铁死亡诱导剂的敏感性［24］。DODSON 等［25］发现，NRF2 正调控了铁死亡的关键蛋白，并能促进其下游靶点的转录，如SLC7A11、G6PD 和FTH176。这些基因参与脂质过氧化和铁代谢，能够在转录激活后负调节铁死亡。NRF2 抑制剂及其下游靶点可能是增强PDAC 细胞对吉西他滨的敏感性的重要靶点。NRF2 抑制剂联合铁死亡诱导剂可能是杀死吉西他滨耐药细胞的可行策略。

热休克蛋白家族A 成员5（heat shock protein 5，HSPA5）是主要在内质网中表达的分子伴侣蛋白。最近研究显示，HSPA5 过表达能够抑制（胰腺导管腺癌）PDAC 细胞铁死亡，防止GPX4 的降解，并抑制铁死亡过程中的脂质过氧化。研究发现，当吉西他滨与HSPA5 抑制剂联合用于治疗PDAC 时，其治疗效果明显增加，这是通过诱导PDAC 铁死亡来实现的。ZHU 等［26］通过实验发现激活转录因子4（ATF4，一种氨基酸感应蛋白）导致HSPA5 表达增加，进而结合谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）来防止GPX4 蛋白降解和随后的脂质过氧化。这项研究表明HSPA5-GPX4 通路的强化表达可以导致吉西他滨耐药。相反，在体外和小鼠胰腺癌动物模型中，使用EGCG（儿茶素）或柳氮磺胺吡啶等铁死亡诱导剂抑制HSPA5-GPX4 通路能够增强了吉西他滨在PDAC 细胞中的敏感性。所以，抑制HSPA5 表达可以提高胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。吉西他滨与靶向HSPA5 抑制剂的联合应用可能是未来胰腺癌化疗的新方法。

综上所述，通过抑制System XC--GSH-GPX4 通路，降低胰腺癌细胞内GSH/GPX4 水平能够改善胰腺癌细胞吉西他滨耐药，为晚期胰腺癌患者联合化疗提供了新的研究方向。

3.2 铁离子代谢通路与耐药羰基还原酶1（CBR1）是一种NADPH 依赖性酶，通过抑制化疗药物治疗过程中的氧化应激来保护癌细胞。白杨素是一种天然生物类黄酮，广泛存在于蜂胶、蜂蜜和蓝色西番莲（西番莲）中，已被证明是强效CBR1抑制剂。有研究发现，白杨素直接与CBR1 结合，在分子和细胞水平上抑制其酶活性，通过抑制CBR1，诱导FTH1（重组人铁蛋白重链）的降解并导致细胞内游离铁的增加，然后通过产生高活性羟基自由基参与Fenton 反应［27］促进胰腺癌细胞铁死亡。研究发现，经过白杨素处理后的胰腺癌细胞内脂质过氧化增强和亚铁离子（Fe2+）水平显著增加。此外，白杨素处理后，PANC-1 细胞的线粒体变小，线粒体膜不清晰，线粒体嵴减少甚至消失［28］，这进一步表明白杨素导致了胰腺癌细胞铁死亡的发生。这也表明了作为CBR1 抑制剂的白杨素可通过靶向抑制CBR1，通过促进细胞铁离子代谢，增加细胞内铁离子水平从而诱导细胞铁死亡，增加胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。

3.3 脂质过氧化通路与耐药ADP核糖基化因子6（ARF6）是RAS 超家族中参与调节囊泡运输、膜脂质重构和信号通路的重要因子。有研究发现，ARF6 能够促进胰腺癌细胞的增殖。ARF6 并不直接调节脂质过氧化，但赋予胰腺癌细胞一种对氧化应激敏感的状态，特别是RSL3 诱导的脂质过氧化。进一步研究发现ARF6 缺失会使ACSL4 蛋白表达上调，但对mRNA 表达无影响。这表明ARF6在翻译后水平上对ACSL4 有正性调节作用，并通过将细胞脂质组成塑造为易于氧化的状态来提高erastin、RSL3 等铁死亡诱导剂改善吉西他滨耐药性的效果［29-30］。然而，氧化状态调控机制与改善吉西他滨耐药性的关系有待进一步研究。这一发现为调节肿瘤微环境、抑制肿瘤干细胞抑制等抗耐药方法提供新思路。

3.4 其他诱导通路与耐药有报道说，将Erastin（一种铁死亡诱导剂）与吉西他滨联合使用可以增强吉西他滨对胰腺癌细胞的细胞毒性作用［31］。该研究还证实，铁死亡诱导剂RSL3 也可以增加吉西他滨对胰腺癌的治疗效果，而铁死亡抑制剂Fer-1具有相反的作用。这些实验证实了诱导胰腺癌细胞铁死亡可降低胰腺癌细胞对吉西他滨治疗的耐药性。YE 等［32］研究证实了一种称为FBW7（F 框/WD-40 域蛋白7，F-box and WD-40 domain protein 7）的酶，以影响吉西他滨的敏感性。研究发现FBW7可以促进胰腺癌细胞铁死亡，推测它可能通过铁死亡和细胞凋亡机制影响吉西他滨的细胞毒性。YE 等［32］使用铁死亡抑制剂Fer-1 和凋亡抑制剂zVAD 治疗FBW7 过表达的细胞，发现两种治疗均能抵消FBW7 过表达对吉西他滨的影响。因此，证实FBW7 通过铁死亡和凋亡增强了吉西他滨的细胞毒性作用。这一发现表明促进FBXW7 表达可以通过铁死亡途径来降低吉西他滨的耐药性。其具体机制尚待进一步深化研究，为吉西他滨联合治疗方案的更新提供了新想法。

含三联基序11（TRIM11）蛋白在肿瘤发生发展中起着至关重要的作用，其可通过发生自聚泛素化，以抑制癌细胞选择性自噬作用。UBE2N 是一种泛素结合酶（E2），参与蛋白质的泛素化修饰的过程。SHANG 等［33］研究发现TRIM11 能够促进UBE2N 表达，抑制胰腺癌细胞铁死亡并降低肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性。柠檬酸铁铵（FAC）能够诱导PDAC 细胞发生铁死亡，是一种铁死亡诱导剂。SHANG 等［33］还发现FAC 诱导PDAC 细胞铁死亡是通过降低TRIM11 的表达实现的，进而逆转PDAC 细胞对吉西他滨敏感性的抑制作用。然而，抑制TRIM11 与吉西他滨耐药发生发展的内在联系尚不明确，深入研究TRIM11 改善耐药机制为胰腺癌靶向治疗提供了新的思路与方向。总的来说，多项实验发现诱导胰腺癌细胞铁死亡能够改善其对吉西他滨的耐药性，但其调控机制与吉西他滨耐药发生的内在联系尚不明确，具体分子调控机制有待深入研究。为晚期胰腺癌患者的吉西他滨联合化疗方案需进一步更新拓展了新方向。

4 展望

吉西他滨是晚期胰腺癌患者的一线化疗药物。其治疗作用的限制性在随着治疗过程的进展逐渐显现出来，如肿瘤细胞对其耐药性会随之增强。基于铁死亡机制改善胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性是现在胰腺癌治疗研究的一大热点。越来越多的实验发现联合应用吉西他滨与铁死亡诱导剂相比于单独应用吉西他滨治疗可以明显提高肿瘤治疗效果，但其改善耐药性的具体分子机制尚不明确。联合治疗所表现出更好的治疗是基于诱导胰腺癌细胞铁死亡和吉西他滨抑制DNA 复制过程的协同作用，或是由于铁死亡能够对吉西他滨的耐药改善还有待进一步研究证明。此外，引起胰腺癌细胞铁死亡的脂质过氧化物阈值以及脂质过氧化物对吉西他滨代谢的影响尚有待进一步研究与探讨。深入研究铁死亡改善胰腺癌细胞对吉西他滨耐药性的分子机制和相关信号转导通路对胰腺癌的治疗具有重要意义，为未来肿瘤靶向治疗提供新的研究方向和思路，为人类与“癌中之王”的抗争提供更加强效的武器。