miR-27a靶向调节TLR4减轻糖尿病妊娠大鼠氧化应激和炎症损伤

张翠翠 孙文萍 谢玲

青海红十字医院产一科（西宁 810099）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）与早期和晚期胚胎死亡、胎儿生长障碍和胎盘异常有关［1］。在GDM 中检测到胎盘组织中较高的炎症反应［2］。MicroRNA（miRNA）在GDM 中存在异常表达，是GDM 的有效诊断标志物［3］。据报道，miR-27a 是治疗肥胖和糖尿病胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）的新靶点，其过表达可通过调节Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路抑制炎症反应［4-5］。通过对miR-27a 的靶基因进行分析发现，miR-27a 有多个靶基因，包括TLR4［6］。在众多靶基因中，TLR4 在GDM 女性脐带血和胎盘中表达增加［7］；且TLR4/MyD88/NF-κB 通路在GDM 中被激活，与氧化应激和炎症密切相关［8］。miR-27a 能否通过TLR4 介导GDM 发生、发展尚未明确。因此，本研究探讨miR-27a 在GDM 中的表达及潜在机制，为GDM 的诊断和机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物70 只雌性和35 只雄性SD 大鼠（6～8 周龄，体质量180～200 g）购自河南省实验动物中心［SCXK（豫）2017-0001］，饲养在受控环境条件下：温度（23 ± 1）℃、湿度（50 ± 10）%和12 h∶12 h 光暗循环。实验经机构动物护理和使用委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）（北京索莱宝科技有限公司，货号：S8050）；miR-27a agomir 和miR-27a agomir 阴性对照（agomir-NC）由广州RiboBiotech 公司合成；脂多糖（LPS，TLR4激活剂）（S1732）、HE 染色液（C0105S）、TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光，C1088）（碧云天生物科技公司）；兔源一抗TLR4（bs-20595R）、MyD88（bs-1047R）、NF-κB p65（bs-23216R）、β-actin（bs-0061R）、Lamin B1（bs-55118R）和二抗山羊抗兔IgG（H+L）/HRP（bs-40295G）（北京博奥森生物技术有限公司）。

Accu-Chek Active 型罗氏活力血糖仪（罗氏血糖健康医护公司）；ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪（美国应用生物系统公司）。

1.3 模型制备将发情期的雌性与雄性大鼠以2∶1 的比例合笼交配过夜。第2 天早上，对雌性大鼠进行阴道涂片，光学显微镜下观察到出现阴道栓（黏液栓）或精子，证实怀孕，被视为妊娠的第0 天。每只怀孕的大鼠都被放置在一个单独的笼子里，并一直跟踪到怀孕结束。

将获得的64 只怀孕大鼠，随机选取12 只为对照组（control 组），剩余52 只大鼠一次性腹腔注射65 mg/kg STZ 溶液（妊娠第1 天），并给予高脂高糖饲料喂养，复制GDM 模型［9］；control 组给予普通饲料喂养，并注射等量柠檬酸缓冲液。注射STZ 后第3 天（妊娠第4 天），出现糖尿病状态，表现为多尿、烦渴、多食等体征；使用血糖仪测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平，若FBG＞16.7 mmol/L 即为糖尿病。共48 只大鼠造模成功。

1.4 动物分组及给药将造模成功的48 只大鼠分为模型组（model 组）、agomir-NC 组、miR-27a agomir 组、miR-27a agomir+LPS 组，每组12 只。分组完成后，agomir-NC 组和miR-27a agomir 组大鼠每3 天静脉内（尾静脉）注射相应的agomir-NC 或miR-27a agomir（10 μmol/L），miR-27a agomir+LPS组大鼠在尾静脉注射miR-27a agomir 的同时腹腔注射LPS（100 μg/kg），control 组和model 组大鼠注射等量生理盐水，直到妊娠第19 天。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 FBG 和FINS 水平检测禁食10 h 后，取各组大鼠尾静脉血，血糖仪检测FBG 水平；另取腹主动脉血样，分离血清，ELISA 法检测FINS 水平。计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）：［FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）］/22.5。

1.5.2 妊娠结局和胎盘质量检测妊娠第19天时，对孕鼠行剖宫产，取出胎鼠并观察窝产仔数、活胎率及胎鼠体质量，并剥离胎盘，称取胎盘质量。

1.5.3 炎症因子水平检测取适量胎盘组织，剪碎后加入预冷的生理盐水，制成10%的组织匀浆，在4 ℃下以2 000 ×g离心10 min，取上清，采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α 水平。

1.5.4 氧化应激指标检测使用检测试剂盒通过紫外-可见分光光度法测定胎盘组织匀浆上清液中SOD、CAT 活性以及MDA 含量。分别在560、405或532 nm 处检测各组的OD值，计算SOD 活性、CAT 活性和MDA 含量。

1.5.5 苏木精-伊红（HE）染色观察胰腺和胎盘组织病理学变化将胰腺和胎盘组织在4%甲醛溶液中固定后，石蜡包埋，切片（5 μm 厚）行HE 染色，光镜下观察胰腺和胎盘组织的病理学变化。

1.5.6 TUNEL 检测胰腺和胎盘组织细胞凋亡取石蜡包埋的胎盘和胰腺组织切片，在37 ℃下与TUNEL 染色液孵育1 h，DAPI 染核。在荧光显微镜下观察凋亡细胞数和细胞总数，计算TUNEL 阳性细胞百分比。绿色表示凋亡细胞。

1.5.7 实时定量PCR（RT-qPCR）检测胎盘组织miR-27a与TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平用TRIzol 试剂提取胎盘组织中的总RNA，反转录为cDNA，在RT-qPCR仪上进行扩增。U6、GAPDH作为参考基因以标准化目的基因的表达。采用2-ΔΔCt方法进行定量。

表1 用于RT-qPCR 的引物序列Tab.1 Primer sequence for RT qPCR

1.5.8 Western blot 分析RIPA 裂解液分离胎盘组织总蛋白，并提取细胞核蛋白。10% SDS-PAGE分离蛋白质并转膜，封闭2 h 后将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜：TLR4（1∶1 000）、MyD88（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶500）和Lamin B1（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）。膜与二抗（1∶10 000）在室温下孵育1 h。显影，使用Image J 软件分析结果。

1.6 统计学方法使用GraphPad Prism 软件（第8 版）分析数据，数据表示为（）。多组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组FBG、FINS 水平和HOMA-IR与control 组比，model 组FBG、FINS 和HOMA-IR 升高（P＜0.05）；与model 组比，miR-27a agomir 组上述指标降低（P＜0.05）；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir+LPS 组上述指标升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠FBG、FINS 水平和HOMA-IR 比较Tab.2 Comparison of FBG，FINS levels and HOMA-IR in rats of each group ±s

表2 各组大鼠FBG、FINS 水平和HOMA-IR 比较Tab.2 Comparison of FBG，FINS levels and HOMA-IR in rats of each group ±s

注：与control 组比，#P＜0.05；与model 组比，*P＜0.05；与miR-27a agomir 组比，Δ P＜0.05

组别control组model组agomir-NC组miR-27a agomir组miR-27a agomir+LPS组F值P值FBG（mmoL/L）7.34±1.01 16.69±2.12#17.04±2.36#9.52±1.48#*14.39±1.55#*Δ 72.733＜0.001 FINS（mU/L）4.25±0.63 13.18±1.49#12.64±1.25#7.52±0.86#*10.61±1.32#*Δ 126.141＜0.001 HOMA-IR 1.39±0.22 9.78±1.35#9.57±1.24#3.18±0.50#*6.79±0.86#*Δ 193.587＜0.001

2.2 各组妊娠结局和胎盘质量与control 组比，model 组大鼠窝产仔数、活胎率降低，胎鼠体质量和胎盘质量升高（P＜0.05）；与model 组比，miR-27a agomir 组大鼠窝产仔数、活胎率升高，胎鼠体质量和胎盘质量降低（P＜0.05）；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir + LPS 组大鼠窝产仔数、活胎率降低，胎鼠体质量和胎盘质量升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠妊娠结局和胎盘质量比较Tab.3 Comparison of pregnancy outcome and placenta quality of rats in each group ±s

表3 各组大鼠妊娠结局和胎盘质量比较Tab.3 Comparison of pregnancy outcome and placenta quality of rats in each group ±s

注：与control 组比，#P＜0.05；与model 组比，*P＜0.05；与miR-27a agomir 组比，Δ P＜0.05

组别control 组model 组agomir-NC 组miR-27a agomir 组miR-27a agomir + LPS 组F 值P 值窝产仔数（只）8.92 ± 1.51 6.75 ± 0.97#6.58 ± 1.08#8.33 ± 1.37*6.83 ± 1.11#Δ 9.128＜0.001活胎率（%）96.53 ± 5.18 84.89 ± 2.21#86.28 ± 7.79#93.38 ± 8.03*85.38 ± 6.37#Δ 8.573＜0.001胎鼠体质量（g/只）5.12 ± 0.70 6.34 ± 0.65#6.29 ± 0.74#5.36 ± 0.61*6.18 ± 0.82#Δ 7.877＜0.001胎盘质量（g）0.50 ± 0.07 0.69 ± 0.08#0.64 ± 0.09#0.55 ± 0.07*0.67 ± 0.08#Δ 12.997＜0.001

2.3 各组大鼠胎盘组织IL-1β、TNF-α 水平与control 组比，model 组IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；与model 组相比，miR-27a agomir 组上述指标降低（P＜0.05）；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir+ LPS 组上述指标升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠胎盘组织IL-1β、TNF-α 水平比较Tab.4 In placental tissue of rats in each group IL-1β，TNF-α Horizontal comparison ±s，pg/mL

表4 各组大鼠胎盘组织IL-1β、TNF-α 水平比较Tab.4 In placental tissue of rats in each group IL-1β，TNF-α Horizontal comparison ±s，pg/mL

注：与control 组比，#P＜0.05；与model 组比，*P＜0.05；与miR-27a agomir 组比，Δ P＜0.05

组别control 组model 组agomir-NC 组miR-27a agomir 组miR-27a agomir+LPS 组F 值P 值IL-1β 21.39 ± 3.24 65.08 ± 6.12#63.62 ± 6.45#39.59 ± 5.36#*52.28 ± 6.27#*Δ 126.787＜0.001 TNF-α 30.53 ± 4.18 94.25 ± 7.20#90.86 ± 7.34#55.01 ± 6.52#*79.45 ± 8.06#*Δ 188.268＜0.001

2.4 各组大鼠胎盘组织SOD、CAT 活性和MDA含量与control 组比，model 组SOD 和CAT 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）；与model 组比，miR-27a agomir 组SOD 和CAT 活性升高，MDA 含量降低（P＜0.05）；与miR-27a agomir组比，miR-27a agomir+LPS 组SOD 和CAT 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠胎盘组织SOD、CAT 活性和MDA 含量比较Tab.5 Comparison of SOD，CAT activity and MDA content in placental tissue of rats in each group ±s

表5 各组大鼠胎盘组织SOD、CAT 活性和MDA 含量比较Tab.5 Comparison of SOD，CAT activity and MDA content in placental tissue of rats in each group ±s

注：与control 组比，#P＜0.05；与model 组比，*P＜0.05；与miR-27a agomir 组比，Δ P＜0.05

组别control 组model 组agomir-NC 组miR-27a agomir 组miR-27a agomir+LPS 组F 值P 值SOD（U/mgprot）19.58 ± 2.24 5.23 ± 1.17#5.18 ± 1.06#13.42 ± 1.54#*7.09 ± 1.21#*Δ 208.724＜0.001 CAT（U/gprot）0.61 ± 0.07 0.27 ± 0.05#0.24 ± 0.04#0.49 ± 0.06#*0.36 ± 0.05#*Δ 95.483＜0.001 MDA（nmol/mgprot）1.14 ± 0.20 4.20 ± 0.53#4.25 ± 0.48#2.37 ± 0.35#*3.45 ± 0.41#*Δ 125.215＜0.001

2.5 各组大鼠胰腺和胎盘组织病理学变化control组胰腺组织形态正常；model 组病理改变明显，胰岛明显萎缩，细胞数量减少，分布稀疏，排列无序，部分大鼠胰腺腺泡细胞出现液泡变性并伴有不同程度的炎性细胞浸润；与model 组比，miR-27a agomir 组胰腺组织病变减少，胰岛轻度萎缩，部分胰岛可见少量炎性细胞浸润；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir+LPS 组胰腺病理损伤程度增加，炎症细胞浸润更严重。见图1。

图1 各组大鼠胰腺和胎盘组织病理学变化（HE，× 100）Fig.1 Histopathological changes of pancreas and placenta of rats in each group（HE，× 100）

control 组胎盘细胞分布均匀致密，毛细血管分布均匀；model 组大鼠胎盘组织分层边界不明显，细胞分布松散无序，间隙变大，毛细血管分布减少；与model 组比，miR-27a agomir 组大鼠的胎盘损伤减少，细胞排列较为有序，间隙变小，毛细血管分布增多；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir+LPS 组大鼠的胎盘上述损伤加重。见图1。

2.6 各组大鼠胰腺和胎盘组织细胞凋亡与control组比，model 组胰腺和胎盘组织细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与model 组比，miR-27a agomir 组上述指标降低（P＜0.05）；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir+LPS 组上述指标升高（P＜0.05）。见图2、表6。

图2 各组大鼠胰腺和胎盘组织的细胞凋亡（TUNEL，×100）Fig.2 Apoptosis of pancreatic and placental tissues of rats in each group（TUNEL，×100）

表6 各组大鼠胰腺和胎盘组织细胞凋亡率比较Tab.6 Comparison of apoptosis rates of pancreatic and placental tissues of rats in each group ±s，%

表6 各组大鼠胰腺和胎盘组织细胞凋亡率比较Tab.6 Comparison of apoptosis rates of pancreatic and placental tissues of rats in each group ±s，%

注：与control 组比，#P＜0.05；与model 组比，*P＜0.05；与miR-27a agomir 组比，Δ P＜0.05

组别control 组model 组agomir-NC 组miR-27a agomir 组miR-27a agomir+LPS 组F 值P 值胰腺组织细胞凋亡率2.04 ± 0.25 21.36 ± 2.48#20.85 ± 2.32#8.23 ± 1.89#*14.65 ± 2.07#*Δ 212.984＜0.001胎盘组织细胞凋亡率1.23 ± 0.20 12.46 ± 1.59#12.38 ± 1.47#4.51 ± 0.62#*8.27 ± 1.30#*Δ 213.637＜0.001

2.7 各组大鼠胎盘组织miR-27a与TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平与control 组比，model组miR-27a 水平降低，TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平升高（P＜0.05）；与model 组比，miR-27a agomir 组miR-27a 水平升高，TLR4、MyD88、NFκB p65 的mRNA 水平降低（P＜0.05）；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir+LPS 组miR-27a 水平降低，TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平升高（P＜0.05）。见表7。

表7 各组大鼠胎盘组织miR-27a 与TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平比较Tab.7 MiR-27a，TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group Comparison of mRNA level ±s

表7 各组大鼠胎盘组织miR-27a 与TLR4、MyD88、NF-κB p65 的mRNA 水平比较Tab.7 MiR-27a，TLR4，MyD88 and NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group Comparison of mRNA level ±s

注：与control 组比，#P＜0.05；与model 组比，*P＜0.05；与miR-27a agomir 组比，Δ P＜0.05

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2.8 各组大鼠胎盘组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 的蛋白水平与control 组比，model 组TLR4、MyD88 和核NF-κB p65 蛋白水平升高（P＜0.05）；与model 组比，miR-27a agomir 组上述指标降低（P＜0.05）；与miR-27a agomir 组比，miR-27a agomir + LPS 组上述指标升高（P＜0.05）。见图3、表8。

图3 各组大鼠胎盘组织TLR4、MyD88 和核NF-κB p65蛋白表达Fig.3 TLR4，MyD88 and nuclear NF-κB p65 in placental tissue of rats in each groupprotein expression

表8 各组大鼠胎盘组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白水平比较Tab.8 TLR4，MyD88，NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group protein level comparison ±s

表8 各组大鼠胎盘组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白水平比较Tab.8 TLR4，MyD88，NF-κB p65 in placental tissue of rats in each group protein level comparison ±s

注：与control 组比，#P＜0.05；与model 组比，*P＜0.05；与miR-27a agomir 组比，Δ P＜0.05

组别control 组model 组agomir-NC 组miR-27a agomir 组miR-27a agomir+LPS 组F 值P 值TLR4/β-actin 0.21 ± 0.04 0.50 ± 0.06#0.46 ± 0.05#0.33 ± 0.04#*0.41 ± 0.05#*Δ 67.475＜0.001 MyD88/β-actin 0.15 ± 0.03 0.43 ± 0.05#0.42 ± 0.06#0.23 ± 0.04#*0.34 ± 0.05#*Δ 80.162＜0.001 NF-κB p65/Lamin B1 0.12 ± 0.02 0.30 ± 0.04#0.29 ± 0.03#0.16 ± 0.03*0.22 ± 0.04#*Δ 69.111＜0.001

3 讨论

本研究结果显示，miR-27a 的过表达可通过降低FBG、FINS 和HOMA-IR 以及改善GDM 大鼠的胰腺和胎盘组织损伤和细胞凋亡发挥保护作用。此外，miR-27a 过表达后促炎和氧化应激标志物的水平显著降低，抗氧化应激标志物水平升高，这表明miR-27a 的过表达可以减轻GDM 大鼠胎盘炎症和氧化应激，进而减轻IR，改善妊娠结局。提示miR-27a 可能在GDM 发生发展中起重要作用。

TLR4 在受到刺激后，会激活MyD88，诱导NFκB 易位至细胞核，触发促炎细胞因子产生，包括IL-6、IL-1β、TNF-α，从而促进GDM 发展［10］。抑制GDM 小鼠TLR4/NF-κB 通路激活，可改善胎盘氧化应激和炎症以及胎儿结局［11］。TLR4 是miR-27a 的直接靶点，据报道，miR-27a 可通过靶向TLR4 减弱LPS 刺激的小胶质细胞激活中的炎症反应［12］。本研究观察到，在GDM 大鼠胎盘中TLR4、MyD88 和NF-κB p65 的表达均增加，表明TLR4/MyD88/NFκB 通路被激活；而miR-27a 的过表达阻止了NF-κB p65 从细胞质转移到细胞核；此外，使用TLR4 激活剂LPS 激活TLR4/MyD88/NF-κB 通路可减弱miR-27a 过表达对GDM 大鼠胎盘炎症反应和氧化应激的抑制作用。提示miR-27a 过表达可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB 通路，减轻GDM 大鼠胎盘炎症反应和氧化应激。

综上所述，miR-27a 过表达可减轻GDM 大鼠胎盘炎症反应和氧化应激，减轻IR，其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路激活有关。表明miR-27a 可能是GDM 的潜在靶点，对GDM 的诊断和治疗具有重要的意义。但由于GDM 中miR-27a 的研究相对较少，本研究结论尚需更多的体内外实验进一步验证。