牛支原体诊断技术的研究进展

汪梦竹，蒲飞洋，赵泽阳，冯茜莉，王慧慧，李易聪，李倬，赵永清

（1西北民族大学生物医学研究中心，兰州 730030；2西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730010）

0 引言

支原体属于柔膜细菌纲，革兰氏染色呈阳性，无细胞壁，广泛分布于自然界中。迄今为止，从动物体内分离并鉴定出的支原体数量繁多，但大部分对动物不致病，其中仅有少部分支原体在牛身上具有不同程度的临床意义[1]。牛支原体是公认的与牛疾病有关的最重要的支原体之一，1961年美国一个爆发乳腺炎的奶牛场中分离出的牛支原体菌株PG45，目前作为牛支原体国际参考株，已完成了全序测定[2]。另外，包括加利福尼亚支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛眼支原体、Leachii 支原体、殊异支原体、犬支原体、canadense支原体、产碱支原体、精氨酸支原体和文氏支原体[3]等也在不同程度上对牛具有一定的致病作用。

支原体感染牛后可引起多种疾病，包括乳腺炎、关节炎、肺炎、中耳炎和生殖紊乱等[4]。临床上支原体感染所致的乳腺炎特点是多感染区，并对治疗无反应，且存在亚临床乳腺感染表现[5]；成年牛和犊牛会同时受到关节炎[6]和肺炎[7]的影响，而中耳炎通常只在小牛身上发生[8]；有关支原体感染所致的生殖疾病包括外阴阴道炎、不孕症、子宫内膜炎、难产等[9]。支原体传染性强、变异性强、对治疗的反应性差、易与其他病原混合感染，而支原体的诊断结果对后续扑杀影响极大，因此，快速且准确的诊断对于控制和预防相关疾病的暴发非常重要。本研究将对牛支原体不同诊断方法的发展和应用进行阐述（表1）。

表1 牛支原体不同诊断方法的优缺点

1 微生物培养

通过微生物培养的方式对牛支原体鉴定和检测是比较传统且较常用的。支原体的结构简单，G+C含量低(23%～40%)，编码氨基酸的基因数量很少，合成脂肪酸的能力也较低[10]。培养支原体需考虑到其生物合成力低的特点，为其提供足够的营养物质，需选用特异性的培养基进行培养，所用培养基应富含牛心浸液、血清、酵母抽提物、蛋白胨和其他营养物质，酸碱度控制在pH 7.3～7.8[11]。将接种后的培养基在37℃、5%CO2条件下孵育7～10 d后，可在光学显微镜下观察其菌落呈“煎蛋”状。

传统的支原体培养鉴定方法操作简单、成本低，但也有一定局限性，如支原体的样本收集、处理和储存要求比较严格，样品活性易丧失，培养周期长并易受杂菌污染等。为避免其活性丧失或被杂菌污染，在采样时，应迅速将采集到的样品收集至无菌容器中，可于4℃条件下短暂保存，尽快进行实验室培养。如果在2 d内不能培养，需将样品冷冻，但这会使支原体菌落形成单位明显降低[12]。同时，重复解冻也会导致活菌的减少，且无论样品是否冷藏或冷冻，支原体的回收率都会随着保存时间的增加而降低。如果样品收集和储存不当，可能会有假阴性结果。在适当的样本采集和储存方案下，支原体生长速度依旧缓慢，菌落出现需要5～10 d。而想要通过培养来诊断支原体感染，必须采集有活力的支原体样本。对支原体感染的病例实际情况观察研究后，发现慢性和亚临床支原体乳腺炎病例的牛支原体通常间歇性脱落，为了提高慢性或亚临床乳腺炎病例以及BTM样本中检测支原体的可能性，应在数天内采集多个样本，一般采集3 个样品至少收集3～4 d，再进行培养[13]。

为防止其他细菌干扰，分离培养时可向培养基中添加抗菌剂如醋酸铊或抗生素[14]。虽然添加的抗菌剂通常会抑制其他细菌的生长，但支原体生长培养基仍有可能出现几种柔膜纲类。其中，无胆甾原体和支原体形态均呈“煎蛋”状，不能单靠培养鉴别，易导致假阳性出现，可应用洋地黄素的敏感性作为鉴别支原体和无胆甾原体属的附加步骤[15]。为保证分离培养菌株为支原体，在分离后应进一步通过聚合酶链式反应(PCR)对培养的阳性菌株进行物种鉴定。

2 分子水平的诊断

2.1 常规PCR检测

与传统的培养基诊断方法相比，利用PCR检测不同样本类型支原体的方法具有高效性、特异性和敏感性。目前已有可识别单个及多个支原体物种的PCR检测方法。以16S rRNA基因为靶点的常规PCR检测方法始于20世纪90年代[16]，早期PCR检测的检测限在肉汤培养基中为4×102cfu/mL，于24 h内可得到结果，比培养法更高效。虽然这些针对牛支原体16S rRNA基因的PCR检测可检出大多数支原体物种，但是对于无乳支原体（一种影响小型反刍动物的物种）的特异性较弱[17]。因此，提高支原体检测的特异性也成为科学家不断探索的目标。一种利用牛支原体p81基因设计出的多重PCR 检测技术应运而生，该检测方法通过PCR-RFLP法对牛支原体p81基因进行测序和分析，极大地提高了支原体检测的特异性[18]。

由于牛支原体不是唯一对牛有诊断价值的支原体物种，PCR检测方法的进一步发展使其在检测其他支原体种类上也取得了较大进展。其中，16S rRNA基因已被用作靶标，开发了殊异支原体和无乳支原体的种特异性PCR[19]。为了检测多个物种，以16S～23S rRNA间隔区为靶点的PCR 检测方法应运而生，16S～23S rRNA基因间隔区是位于2个核糖体RNA之间的结构区域，对蛋白质合成至关重要[20]。虽然这种设计不是专门针对牛的支原体，但它作为广泛应用的检测方法对牛支原体同样适用。DNA扩增后，所得产物在琼脂糖凝胶上运行后产生的带型可区分支原体和无胆甾原体。

鉴定多种支原体物种的方法通常是使用多种引物，由琼脂糖凝胶上的产物确定物种[21]。用该方法测定产碱支原体、牛生殖道支原体、牛鼻支原体、牛支原体的检出限分别为1.4×103、1.7×102、1.1×102、4×102cfu/mL，低于培养基法（其检测限分别为1.4×104、1.7×103、1.1×103、1×103cfu/mL）。最近的一项研究证明了传统PCR和序列分析法(sequence analysis)可对几种支原体和无胆甾原体进行鉴别，包括精氨酸支原体、产碱支原体、牛生殖道支原体、canadense支原体、牛鼻支原体、加利福尼亚支原体、laidlawii支原体和无胆甾原体[22]。

2.2 实时PCR检测

随着技术的进步，实时PCR检测支原体的方法得到了发展，SYBR green染料法和荧光探针法作为常用的实时PCR检测方式，在支原体检测中也发挥着巨大的作用。

SYBR green染料在游离状态下可发出微弱荧光，但其可与所有双链DNA结合，结合后在特定波长的光激发下产生520 nm 的荧光信号。随着PCR 循环的进行，目标双链DNA 的数量增加，染料发出的光量按比例增加，可实时检测PCR产物[23]。由于SYBR green并不针对特定的目标序列，不需要合成特定的寡核苷酸序列，因此其相对方便快捷[24]。然而，由于SYBR green 能与所有双链DNA 结合，与基于探针的实时PCR 方法相比，其特异性较差[25]。这种方法在牛的支原体检测中不太常用，但可基于支原体属的16S～23 S基因间隔区检测散装牛奶样品中的多个支原体属。早期PCR检测的检测限在肉汤培养基中为4×102cfu/mL，在牛奶样品中提取过的DNA为5×102cfu/mL。

为了提高特异性，实时PCR荧光探针法的应用也受到了重视[26]，其中常用的是水解探针。由于水解探针特异性结合目标序列，使背景信号显著降低，这种方法特异性高且定量准确。不同的探针也可以与不同的染料和猝灭剂分子结合，可在单一反应中进行复验，从而节省时间和试剂[27]，目前已开发了几种新的牛支原体实时PCR探针检测法[28]。基于荧光探针的实时PCR测定靶标16S rRNA 基因时会与无乳分枝杆菌表现出交叉反应[29]，而DNA修复基因uvrC具有某些与无乳分枝杆菌不同的独特序列，在后续的研究测定中这些序列作为设计新的引物探针的靶标意义重大[30]。Cezar等[31]基于RD4的引物建立了新型实时定量PCR试验，该方法可以从奶样和血样直接检测牛分枝杆菌。Ziv等[32]设计了一种基于TaqMan探针的双靶标测定方法，靶向牛支原体的管家基因fusA和oppD/F进行检测，进一步提高了检测的准确性。

此外，探针实时PCR技术的进一步发展成功探索出了牛体内其他支原体的鉴定方法。随着技术不断发展，科研人员开发出了3 种新型的探针实时PCR 检测方法，可用于检测牛奶和组织样本中的牛支原体、加利福尼亚支原体和牛生殖支原体[33]。根据每种支原体的特异性选择了3 个不同的靶基因，其中牛支原体的靶基因是fusA编码的延伸因子G，该基因在mRNA 翻译成蛋白质的过程中发挥着重要的作用。牛乳中牛支原体、加利福尼亚支原体和牛生殖道支原体的检出限分别为(10±0)、(22.4±20)、(20±0)cfu/mL[34]。该检测限比先前描述的PCR 检测更为敏感，此外，本研究表明，3种新开发的探针检测方法比作为比较金标准的16S rRNA 基因测序更准确。在发展探针PCR 技术的同时，实时多重PCR 测定也在实践中，目前的测定方法可在单一反应中同时检测牛支原体和其他病原体，如多杀性疟原虫、溶血分枝杆菌和睡眠嗜血杆菌[35]。

2.3 遗传鉴定与分型

随着遗传鉴定技术的不断发展，应用脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、多位点可变数目串联重复分析(multiple locus variable number tandem repeat analysis，MLVA)和多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)等方法对牛支原体分离株进行遗传鉴定的技术日趋成熟。

PFGE被认为是细菌分型的“黄金标准”[36]，目前已广泛应用于支原体菌株的分型和鉴定。AFLP是一种基于PCR的技术，也可用于DNA指纹分析，与其他流行的DNA 标记相比，它在时间、经济性、可重复性、信息性、分辨率和灵敏度方面更有效[37]。利用这项技术，Thomas 等[38]证明牛支原体分离株的病理背景（乳腺炎、肺炎和关节炎）与它们粘附不同宿主细胞系的能力没有相关性。MLVA通过分析基因组中独特序列的差异，确定分离株的亲缘关系，可进行感染溯源。MLST是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，能够准确地从亚种水平进行菌株分类，在鉴定物种的遗传多样性方面发挥重要作用[39]，可用于研究牛支原体的种群结构、进化和传播。对于牛支原体分离株的基因分型，可先使用MLST 来确定菌株，然后使用MLVA 来进行精细的分型。Tardy 等[40]应用该技术对1981—2016 年在丹麦收集的牛分枝杆菌分离株进行了遗传分析，监测了分离株随时间推移的遗传相关性。Manso等[41]开发的MLST 方案基于4 个管家基因（fusA、gyrB、lepA和rpoB），研究了17年间在丹麦分离出的牛支原体菌株的遗传异质性，分辨力可达到0.833。MLST具有较高的分辨率且具有高准确性[42]，但其检测时需要充足的样本，耗时长且成本较高。不同的鉴定方法优势各有不同，也存在着不足之处，因此在实际应用中要根据具体情况选择适宜的分子生物学鉴定分型技术进行分析。

2.4 全基因组测序

随着高通量测序变得快捷便利，全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)成为研究细菌基因组序列的一种广泛使用的工具。WGS 是指对所选菌株的全部基因组进行测序，以便对其结构及功能进一步研究，可用于临床诊断、疾病暴发调查和耐药性控制[43]。全基因组测序已被用于5种牛支原体分离株和2种加利福尼亚支原体分离株，以及单个的精氨酸支原体、牛生殖道支原体、canadensen支原体、牛眼支原体和leachii支原体分离株[44]。虽然这种方法可以获取更详细的支原体信息，揭示相关毒性基因的遗传进化规律，但其很少用于研究大量分离株之间的遗传多样性。

3 血清学诊断

虽然微生物培养法和PCR 诊断可以完成对支原体的检测，但间接ELISA 可检测在血浆、血清和牛奶样本中存在的支原体抗体。该方法可以鉴别那些接触过病原体并产生体液免疫反应的动物，针对牛支原体的许多开发和研究都已投入使用，包括用于血清和牛奶样本的Bio-X 诊断法(Rochefort，Belgium)检测牛支原体抗体的市售间接ELISA试剂盒，已用于若干现场和分析验证研究[45]。

间接ELISA检测方法（图1）是将抗原或抗体结合到固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测，克服了培养法和PCR分析的难点。ELISA可以以体液抗体反应的形式测量检测前被检动物是否接触过支原体，因为在感染后一段时间动物体内仍保持着一定水平的抗体反应，且不受支原体间歇排泄的影响。所以，相对于其他检测方法，应用ELISA 检测到的患病率通常比PCR 或培养法检测到的患病率高出许多。然而，可以检测到牛支原体抗体并不能说明动物感染了牛支原体。这一观点在牛支原体乳腺炎爆发的养殖场中得到了证明，虽然接触牛支原体的动物数量可能很高，但死于疾病或主动脱落支原体的动物比例通常要低得多[46]，这表明仅根据ELISA 结果扑杀动物会导致过度扑杀。因此，ELISA结果应结合其他诊断方法进行综合评估。虽然ELISA不受牛支原体间歇脱落的影响，但因为血清转化的时间不够可能导致假阴性结果。几项涉及感染性实验的结果表明，血清IgG 抗体转化需2～3 周，这是影响ELISA结果的重要因素[47]。

图1 间接ELISA检测方法

而与血清样本相比，牛奶样本中牛支原体抗体水平更低可能无法检测到。这是因为IgG通常是ELISA的检测的关键，血液中生成的IgG 抗体经一系列传递进入牛奶后，其含量降低，且存留时间也较短。一般不用于检测单一牛奶样本，但可用于检测大量的牛奶样品[48]。由于散装牛奶样品(BTM)易于收集，且能代表哺乳牛群，因此通常用PCR或培养法分析作为监测工具以测量不同地区和国家的支原体在牛群中的流行程度。在使用BTM 样本进行抗体检测时，了解BTM 样本变异相关的因素也很重要。Petersen 等[49]研究发现丹麦奶牛群中抗体阳性的幼畜患病率和牛的规模没有显著相关。虽然关于使用间接ELISA 诊断牛支原体仍存在一些问题，但在分析BTM 样本时，ELISA 和PCR结合最实用，可以从不同的生物学角度分析牛群感染状况。

近年来，牛支原体ELISA抗体检测的方法不断更新，中国也在此方面取得了一定成果，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所辛九庆团队研发的牛支原体ELISA抗体检测试剂盒于2017年获得了国家新兽药注册证书[50]。

4 总结

随着养牛业的发展，牛支原体已经在世界范围内传播，一些早期没有该病原体的国家也受到了波及，中国作为养牛大国及牛产品进口大国，近年来也受到了一定影响。支原体病不仅对牛群造成严重危害，也对经济和社会福利造成了负面影响。因此，需要方便快捷的诊断方法以迅速控制和预防相关疾病。

分离培养法提供了一种实用的支原体分离方式，可用于DNA提取及其分型，以调查感染源与其他支原体菌株的亲缘关系。聚合酶链反应可以快速提供诊断结果，有助于及时做出有关临床感染牛的进一步处理决策，以减少疾病传播的风险。血清学诊断为评估不同畜群的病原接触史提供了便捷，为支原体感染的控制提供了科学指导。在生产实践中，诊断方法的应用要结合实际情况，充分考虑预算及成本、检测的可行性与紧迫性以及样本的存放和处理。结合诊断结果，在疫情初期就应尽快隔离病牛，并对其他牛进行紧急接种和预防性用药。在治疗阶段，严禁使用违禁药品，科学合理地使用抗生素，并严格遵守休药期，避免药物残留，保证肉、奶等动物源性产品质量。但目前相关药物难以发挥出很好的作用，达不到治疗目的，所以高效快捷的检测方法仍是研究的重点。在之后的研究中，应积极探索新兴技术，使之与现有检测方法更好融合，以达到防控支原体感染的最终目标。