土茯苓和白土茯苓总黄酮的优化提取及抗氧活性的比较

张光林，肖敏，郑毓安，胡宗礼

韶关学院英东生物与农业学院（韶关 512005）

土茯苓为光叶菝葜科植物Smilax glabraRoxb.的根茎，具有清热利湿、健脾益胃、补益肝肾等功效，常用于中医临床治疗肝肾亏虚、脾胃虚弱、水肿等症状[1-2]。此外，土茯苓是一种常见的食材，含有丰富的总黄酮、维生素和矿物质，如维生素B1、维生素B2、维生素C、钙、铁等，具有促进消化、增进食欲、有利于水肿患者的康复、延缓衰老、保持皮肤弹性和光泽等多种保健作用，因此在食品中有着广泛的应用前景[3]。

一直以来，在食品药品质量检查中常有土茯苓的混淆品，如薯蓣科植物粉萆薢Dioscorea hypoglaucaPalibin的根茎，百合科植物菝葜Smilax chinaL的根茎，百合科植物百合科肖菝葜Heterosmilax japonicaKunth的根茎[4]。不同土茯苓来源、生长环境、采收时间等因素可能会对土茯苓中总黄酮含量和成分产生影响，甚至一些混淆品可能会对患者的健康产生不良影响，因此正确区分土茯苓的混淆品具有重要意义。

试验采用超声辅助-响应面法提取土茯苓、白土茯苓根茎总黄酮，并从料液比、提取溶液乙醇体积分数、超声提取所需时间3个因素优化2种土茯苓根茎总黄酮提取工艺，进一步比较最优提取条件下2种土茯苓提取物总黄酮的抗氧化活性。正确区分土茯苓的混淆品对于消费者的健康有重要保障作用，旨在为土茯苓、白土茯苓总黄酮的提取提供技术指导，为土茯苓综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

土茯苓和白土茯苓药材片（安徽省毫州市福硕堂生物有限公司），经鉴定为百合科（Liliaceae）菝葜属（Smilax）土茯苓（Smilax glabraRoxb.）和百合科（Liliaceae）肖菝葜属（Heterosmilax）白土茯苓（Heterosmilax japonicaKunth）。

芦丁标准品、没食子酸、邻苯三酚（均为Solarbio）；福林酚试剂（北京天恩泽基因科技有限公司）；抗坏血酸（韶关市天安科技有限公司）；1-二苯-2-苦基肼（DPPH，APExBIO）。

紫外分光光度计（T-UV1810，上海佑科仪器仪表有限公司）；精密天平（GL8201i-1SCN，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；离心机（JIDI-16R，广州吉迪仪器有限公司）；精密型电子天平（ME203，梅特勒托利多科技有限公司）；恒温水浴锅（HWS-12，沙鹰科学仪器有限公司）；超声清洗仪（SK2200B，上海科导超声仪器有限公司）；多功能粉碎机（800Y，永康市铂欧五金制品有限公司）。

1.2 土茯苓总黄酮的提取

土茯苓总黄酮的提取采用超声波辅助乙醇提取法。取一定量干燥的土茯苓样品，搅拌机打成粉末，用孔径0.230 mm（65目）过滤筛过滤得到干燥的土茯苓粉，备用。准确称取1.0 g土茯苓粉末，用乙醇溶液溶解，进行超声辅助提取，分别以料液比、提取溶液乙醇体积分数、超声提取时间进行单因素试验，最终得到土茯苓提取液。

1.3 NaNO2-Al(NO3)3比色法测定土茯苓总黄酮含量

总黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法。以芦丁作为标准品，波长510 nm处测吸光度，以吸光度（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y=13.36x-0.011 4，R2=0.995 1。利用标准曲线计算样品总黄酮含量，通过式（1）计算提取物总黄酮得率。

式中：c为经芦丁标准曲线算出的土茯苓提取液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；m为称取的土茯苓粉质量，mg。

1.4 超声波辅助提取土茯苓化学成分的工艺优化

以乙醇体积分数、料液比、提取时间进行单因素试验[5-6]，通过单因素试验优化提取土茯苓总黄酮的条件，应用Design-Expert 12.0软件，分别设计三因素三水平的响应面试验，利用响应面试验结果，确定土茯苓中各化学成分的最佳提取条件。响应面试验因素水平见表1。

表1 响应面设计因素水平表

1.5 土茯苓和白土茯苓总黄酮对DPPH自由基的清除能力测定

取不同质量浓度（15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL）的VC、土茯苓和白土茯苓样品溶液，溶液中加入等体积DPPH溶液（0.1 mg/mL），混匀，避光反应30 min，于517 nm波长处测定反应体系的吸光度。等体积无水乙醇替代DPPH溶液制备溶剂空白组和等体积无水乙醇替代样品溶液制备样品空白组，VC作为阳性对照组。重复3次，根据式（2）计算提取液对DPPH清除率。

式中：A0为相同条件下，等体积DPPH和无水乙醇的吸光度；As为相同条件下，等体积DPPH和样品溶液的吸光度；Ac为相同条件下，等体积无水乙醇和样品溶液的吸光度。

1.6 土茯苓和白土茯苓总黄酮对超氧阴离子自由基清除能力的测定

准确量取配制0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 8.2），在25 ℃恒温水浴锅中保温20 min，加入不同浓度的土茯苓和白土茯苓样品（质量浓度15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL），混匀后加入0.3 mL 25 ℃水浴中预热后的50 mmol/L邻苯三酚试液。振荡摇匀，置于25 ℃恒温水浴锅中反应4 min，反应结束后，向试管中加入0.2 mL 6.0 mol/L HCl溶液终止反应。在325 nm波长处测吸光度，记录数据。以VC作为阳性对照。根据式（3）计算O2-清除率。

式中：A1为相同条件下，邻苯三酚和样品的吸光度；A2为相同条件下，邻苯三酚和蒸馏水的吸光度；A0为相同条件下，蒸馏水和样品的吸光度。

2 结果与分析

2.1 土茯苓和白土茯苓的鉴别

如图1所示，所购买的土茯苓（Smilax glabraRoxb.）药材为干燥切片，表面呈淡红褐色，粗糙，质地较白土茯苓（Heterosmilax japonicaKunth）更加坚硬，难折断，粉末较少，水湿润后有黏滑感。白土茯苓药材为干燥切片，表面呈黄褐色，粗糙，质地坚硬，有较多粉末，加水湿润无黏滑感。

图1 土茯苓和白土茯苓药材片的直观图

图2 乙醇体积分数、料液比和提取时间对提取土茯苓总黄酮的影响

2.2 单因素试验对土茯苓总黄酮得率的影响

通过比较乙醇体积分数、料液比和提取时间单因素试验优化土茯苓总黄酮的提取，得到适宜提取条件：乙醇体积分数70%、料液比1︰30（g/mL）和提取时间30 min，此时总黄酮得率达12.30%~12.86%。

2.3 响应面法分析土茯苓总黄酮的提取

通过响应面法对料液比、乙醇体积分数、提取时间单因素分析，得到提取土茯苓总黄酮试验方案及结果，见表2。

表2 响应面试验设计及结果

通过Design-Expert 12.0软件对表2的数据进行分析，结果如表3所示。结果表明，料液比和提取时间（P＜0.05）对总黄酮提取影响显著。以土茯苓中总黄酮得率为响应值，经回归拟合后，得到回归方程（4）。

表3 方差分析

据方差分析结果，回归方程描述与响应面值之间的关系时因其模型的P＜0.01（显著），差拟项检验的P=0.224 7（不显著），R2=0.939 2，表明模型充分拟合试验数据[5]，该方程是土茯苓中总黄酮得率与提取工艺各参数的合适数学模型，所以，可以利用此回归方程确定土茯苓中总黄酮的最佳提取工艺。

响应面图是三维空间中各试验因子（A乙醇体积分数、B料液比、C提取时间）对响应值的曲面图，直观显示最佳参数及各参数之间的相互作用。图3展示回归分析结果，提取时间和料液比对总黄酮得率影响较大，乙醇体积分数次之。回归分析结果与等高线图所显示的圆心处的极值条件一致[5]。表3回归分析结果也显示提取时间和料液比对总黄酮的得率影响显著（P＜0.05）。

图4 乙醇体积分数、料液比和提取时间对提取白土茯苓总黄酮的影响

通过软件分析确定最佳黄酮提取工艺：乙醇体积分数72%、料液比1︰34（g/mL）、提取时间33 min，在此条件下由回归方程（4）算出的理论值为12.80%。根据所得的分析数据进行2组验证试验，总黄酮平均得率为12.94%，测定结果稳定，偏差不大，证明该结果合理可靠。

2.4 单因素试验白土茯苓总黄酮得率的影响

同理通过比较乙醇体积分数、料液比和提取时间单因素试验优化白土茯苓总黄酮的提取，获得最佳提取条件：乙醇体积分数70%、料液比1︰40（g/mL）、提取时间40 min，此时总黄酮得率为1.70%~1.92%。

2.5 响应面法分析白土茯苓总黄酮的提取

通过响应面法对料液比、乙醇体积分数、提取时间单因素分析，得到提取白土茯苓总黄酮试验方案及结果，见表4。

表4 响应面试验设计及结果

通过Design-Expert 12.0软件对表4的数据进行分析，结果如表5所示。料液比和提取时间（P＜0.05）对总黄酮提取影响显著。以土茯苓中总黄酮得率为响应值，经回归拟合后，得到回归方程（5）。

表5 方差分析

据方差分析结果，回归方程描述与响应面值之间的关系时因其模型的P＜0.000 1（显著），差拟项检验的P=0.474 0（不显著），R2=0.977 7，表明模型充分拟合试验数据[5]，该方程是白土茯苓中总黄酮得率与提取工艺各参数的合适数学模型，所以，可以利用此回归方程确定白土茯苓中总黄酮的最佳提取工艺。

根据回归方程得出不同因子的响应面分析图及相应等值线图结果，见图5。乙醇体积分数、提取时间对总黄酮得率影响较大，料液比次之，表5回归分析结果也与此相吻合，提取时间、料液比二者对应的P值小于0.05，均达到显著水平。

图5 两因素交互作用对白土茯苓总黄酮得率的响应面图和等高线图

通过软件分析确定最佳白土茯苓黄酮提取工艺：乙醇体积分数74%、料液比1︰39（g/mL）、提取时间43 min，此条件下由回归方程（5）算出的理论值为1.92%。根据所得的分析数据进行两组验证试验，总黄酮平均得率为1.95%，测定结果稳定，偏差不大，证明该结果合理可靠。

2.6 土茯苓和白土茯苓提取物对DPPH和超氧阴离子自由基的清除作用

通过检测DPPH和超氧阴离子自由基的清除作用以评价土茯苓和白土茯苓的抗氧活性。标准品抗坏血酸具有较高的清除DPPH和O2-的能力（图6）。通过计算，样品质量浓度为15.625，31.250，62.500，125.000，250.000和500.000 μg/mL时，土茯苓总黄酮含量为2，4，8，16，32和64 μg/mL，而白土茯苓总黄酮含量为0.3，0.6，1.2，2.4，4.9和9.8 μg/mL。土茯苓清除DPPH自由基的能力大于白土茯苓，总黄酮含量达到8 μg/ml以上时，其对DPPH自由基的清除作用趋于稳定，达到84%以上（图6 A）。土茯苓对O-2清除能力大于白土茯苓，总黄酮含量达到32 μg/mL以上时，O2-自由基的清除率稳定在80%以上。结果表明土茯苓和白土茯苓的抗氧活性与总黄酮的含量呈正相关关系。

图6 土茯苓和白土茯苓提取物对DPPH和O2-自由基的清除作用

3 讨论与结论

土茯苓与白土茯苓被广泛应用于中医药和保健食品中，具有较大的市场需求。已报道研究对土茯苓、白土茯苓及易混淆品种从药材性状、粉末特征、显微特征等多个方面进行鉴别[7-12]。以土茯苓、白土茯苓总黄酮含量及抗氧活性为研究对象，探索得到的土茯苓总黄酮最佳提取工艺为乙醇体积分数72%、料液比1︰34（g/mL）、提取时间33 min，总黄酮提取率为12.94%；白土茯苓总黄酮最佳提取工艺为乙醇体积分数74%、料液比1︰39（g/mL）、提取时间43 min，总黄酮提取率为1.95%。李保利等[13]比较普通回流法、索氏提取法和浸渍法提取土茯苓总黄酮，存在过程繁琐、耗费时间长等情况，总黄酮的最佳得率在10%~12%。乔蕾等[14]以70%的乙醇为提取溶剂，采用加热回流提取白土茯苓总黄酮，得率为1.19%，相比于加热回流的方法，试验采用的超声辅助法提取白土茯苓的提取效率更高。抗氧化活性试验表明，总黄酮含量越高抗氧化能力越强，土茯苓比白土茯苓具有更好的抗氧化活性。试验结果为土茯苓、白土茯苓市场上的鉴别及应用提供一定理论依据。