龟甲胶研究发展探析*

李晴,朱香梅,石雨荷,朱珏,童巧珍,2,3

1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208; 2.湘产大宗道地药材种质资源及规范化种植重点研究室,湖南 长沙 410208; 3.湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室,湖南 长沙 410208

龟甲胶的主要原材料是龟甲,龟甲来源于龟科动物乌龟的背部甲壳及腹部甲壳[1-2],是龟甲经煎煮、浓缩制成的固体胶,含有丰富的蛋白质、氨基酸及微量元素,有增强人体免疫功能、耐缺氧、抗疲劳、抗肿瘤、促进消化道吸收、延缓衰老、改善造血功能、促进骨愈合等作用[3-4]。因其功效显著且药性平和,为药食同源之品,相关研究也越来越多。基于此,笔者从龟甲胶炮制提取工艺及鉴别技术、化学成分、药理作用以及现代运用4个方面对龟甲胶的研究阐述如下。

1 炮制提取工艺及鉴别技术

1.1 炮制提取工艺“龟甲胶”一词首次出现在《四川中药志》中,也被称为龟胶、龟板膏等[5]。龟甲胶是龟甲经过熬制提取的精华,经相关炮制后制成具有养阴作用的纯阴之品,在临床中与其他药物配伍使用可调和阴阳,且其滋阴之力比单纯运用龟板效果更佳。《本草求真》云:“龟胶专入肾,经板煎就,气味益阴。”故《神农本草经》有板不如胶之说。《本草必用》言:“中湿有毒,煎胶用良。”现代研究发现[6],经过炮制后的龟甲胶有害元素含量低于龟甲,且药效高于龟甲。胶类药物最常见的炮制方法之一是蛤粉烫[7],其主要目的是运用蛤粉降低胶类中药的黏腻之性,矫正胶类的不良气味,使胶类质地更加酥脆,利于入丸、散剂。《得配本草》言:“止嗽,牡蛎粉炒。养血,酒蒸化。”《中华人民共和国药典》(以下简称《药典》)规定:“龟甲胶味咸、甘,性凉;归肝、肾、心经;其制法为:将龟甲漂泡洗净,分次水煎,滤过,合并滤液(或加入白矾细粉少许),静置,滤取胶液,浓缩(可加适量的黄酒、冰糖及豆油)至稠膏状,冷凝,切成块,晾干,即得”。

随着现代科技的进步,龟甲胶的炮制工艺也有了较大改进。刘艳等[7]采用正交设计实验优选制备龟甲胶过程中龟甲的炮制方法以及煎煮次数,结果龟甲经过48 h蒸制去腐肉,不烫淬,煎煮3次后,胶汁中4种氨基酸含量总和能够达到较高水平,工艺重复性良好,考虑到生产成本因素,结合实地调研结果,厂家多采用煎煮两次的工艺,因此建议龟甲煎煮2次后,滤过骨渣的胶汁可继续用于下一次生产。左蕴泽等[8]考察了龟甲炮制加工中的加压提取时间、煎煮次数、煎煮加水量、压力大小等因素对出胶率的影响,发现龟甲在煎煮压力为80 kPa,煎煮时间为3 h,酌情加5倍水量,煎煮2次最为合适。微波技术是用于炙阿胶、龟甲胶、鹿角胶胶珠的代表性技术,具有可靠性高、成本低、高效环保等特点[9]。程一帆等[10]采用正交法优选微波工艺炮炙龟胶珠时发现,胶材质量以及微波设备使用环境等存在较大的差异,龟胶珠的炮制工艺方法需要依据不同批次的胶类进行调试,因此,炮制前需要用小批量样品进行测试以确定最佳炮制参数。另外,龟甲胶为固体胶类,服用需“烊化兑服”,速溶龟甲胶冲剂为新研制的颗粒剂[11],是一种较为理想的新剂型。

1.2 鉴别技术由于胶类中药需求量较大,且龟甲胶价格较高,掺假现象也屡见不鲜。《中华人民共和国药典》规定了龟甲胶性状鉴别特点是颜色呈深褐色,质硬而脆,断面光亮,对光照视时呈半透明状,气微腥,味淡,但运用性状判断其真伪,不仅对鉴别人员的要求较高且较为复杂,因此需利用现代科学技术,以达到快速、高效鉴别的目的。唐敏等[12]通过UPLC-QTOF/MS技术建立了一种区分巴西龟龟甲胶和中华草龟龟甲胶的方法,采用胰蛋白酶对龟甲胶样品进行酶解,然后测定其酶解肽段以进行比对,通过软件区分二者之间各自的特征肽段以达到鉴别目的。殷学毅[13]利用热分析法对龟甲胶等三种胶类进行区分,将样品放于热分析仪样品室,在空气气氛下,以每分钟5 ℃的速度从20 ℃匀速升到550 ℃,获得不同样品的微商热重曲线和差热分析曲线,根据曲线的特征差异进行区分鉴别,此方法成功率高且清晰直观,也可用于龟甲胶与黄明胶、猪皮胶等其他胶类区分。综上,为保证中药临床使用的安全性和有效性,应逐步完善龟甲胶鉴别技术。

2 化学成分

化学成分的研究对传统中药的发展至关重要,有效的化学成分对于后期的药效研究,相关机制研究及毒理研究都具有重要意义。目前发现,龟甲胶的化学成分主要包括蛋白质、氨基酸、微量元素等。

2.1 蛋白质与氨基酸龟甲胶类似阿胶、鹿角胶等胶类,它的主要组成成分是蛋白质[14]。李春梅等[15]采用激光解析/离子化飞行时间质谱法分析龟甲胶的蛋白质及肽成分,获得了 6 个肽分子量峰,形成了龟甲胶蛋白质/肽的组分质量指纹图谱,可作为龟甲胶的数字质量控制标准,但龟甲胶蛋白质/肽成分最终会水解为氨基酸,这可能并不代表传统中药在发挥药效时的物质。氨基酸是龟甲胶中含量最丰富的化学成分,也是《药典》中明确规定龟甲胶质量控制的重要检测指标。目前,龟甲胶中已分离鉴定出17种氨基酸,包括苏氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、组氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和赖氨酸等。郭尚伟等[16]采用液质联用技术测定出龟甲胶中各氨基酸的含量,其中以甘氨酸和脯氨酸的含量最多。

2.2 微量元素龟甲胶中含有多种对人体有益的微量元素如铬、钴、铜、铁、钼、硒、锌和锰等,对维持人体健康起着重要作用[17-18]。微量元素的含量测定方法包括原子吸收分光光度法[19]、火焰光度法[20]、电感耦合等离子体光谱法[21]、电感耦合等离子体质谱法[22]等。王雨华等[23]通过电感耦合等离子质谱法对龟甲胶和鹿角胶中的微量元素含量进行了比较,发现龟甲胶的镁、锶(10.49 mg·kg-1)含量高于鹿角胶,但锌、铜以及钙的含量要小于鹿角胶,这可能与鹿角胶长于补阳,而龟甲胶长于补阴有关。龟甲胶中锶含量明显高于鹿角胶,锶是人体必需的微量元素之一,与骨生长密切相关,且研究表明,锶具有促进成骨细胞生长和抑制破骨细胞形成的双重功效[24]。但龟甲胶所含元素并非都是有益元素,袁利杰等[25]通过微波消解龟甲胶样品,并采用电感耦合等离子质谱法测定出了砷、铅、铬、镉、铜和汞6种有害元素含量。目前,其毒理成分与药效之间的关系还鲜有报道,有待进一步阐明。

3 药理作用

3.1 止血补血中医常用滋阴药治疗血虚证,龟甲胶“味咸养脉,归心肝肾经”,具有良好的滋阴补血功能[26-27]。现代药理学研究表明,龟甲胶可用于治疗虚劳、吐血衄血、崩漏带下、血虚萎黄等症[28]。聂淑琴等[11]发现,龟甲胶和速溶龟甲胶颗粒均能缩短小鼠的出血时间,改善造血功能。胡海林等[29]发现,龟甲胶能够显著改善大鼠贫血状态,增加外周血中白细胞、红细胞、血红蛋白含量。

3.2 促进软骨细胞增殖龟甲胶干预骨关节炎豚鼠的实验发现[30],龟甲胶不仅能够促进软骨细胞增殖,而且能够上调软骨细胞丝裂原活化蛋白激酶,修复受损细胞,延缓骨关节炎的病程发展。林嘉辉等[31]进一步研究了其治疗骨关节炎的作用机制,发现龟甲胶能减少豚鼠骨关节炎软骨细胞JNK及P38 MAPK基因的表达,促进软骨细胞增殖,抑制凋亡,从而起到治疗骨关节炎的作用。

3.3 抗肿瘤研究表明,龟甲胶可以调节免疫,促进巨噬细胞的吞噬作用[32]。唐宇等[33]将龟甲胶用于环磷酰胺所致的免疫低下大鼠,结果表明,高剂量龟甲胶能够提高脾脏指数、外周血中肿瘤坏死因子-α的浓度及CD3+、CD4+T淋巴细胞的绝对计数。王龙等[34]发现,龟甲胶在提高机体免疫力和白细胞计数方面较鳖甲胶更佳。

3.4 抗衰老中药抗衰老机制包括抗氧化、免疫调节、神经保护、基因损伤修复等[35-36]。王珏等[37]发现,龟鹿二仙胶可以改善化疗后骨髓造血干细胞的老化,其机制可能与调节相关蛋白、减少细胞周期阻滞有关。刘俐等[38]研究表明,龟甲胶能增强阴虚状态下机体抗氧化能力,提高超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量,同时调节相关因子表达,延缓衰老。

3.5 生精盛文[39]研究发现,龟甲胶能够调节生精细胞Bcl-2/Bax凋亡通路,改善大鼠睾丸生精细胞的生精功能,调节线粒体功能等,王策[40]研究发现,龟甲胶可以调节性激素水平。

3.6 其他赵澄等[41]研究发现,龟甲胶治疗胃溃疡机制可能与降低胃液酸度,减少胃泌素分泌有关。

4 现代应用

4.1 治疗骨科疾病膝骨关节炎是最常见的老年骨代谢疾病[42],病机为肝肾亏虚、外感风寒湿邪等[43-45],龟甲胶具有益肾健骨的作用。常茹等[46]采用龟甲胶联合塞来昔布胶囊治疗肝肾亏虚型膝骨性关节炎患者60例,有效率为93.33%。李文顺等[47]采用龟鹿二仙胶汤(龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞子)治疗膝骨关节炎120例,有效率为98.3%。

4.2 治疗男科疾病少、弱精子症是临床男科常见疾病之一[48],属中医学“精少”“无子”范畴。龟甲胶为血肉有情之品,滋阴养肾,填髓益精,取“精不足者补之以味”之意,用于治疗肾阴亏虚型少弱精子症,疗效较好。周海亮等[49]总结名老中医谭新华教授治疗男性不育症经验中指出,龟甲胶作为常用药,治疗阴精不足、虚火旺盛型不育症疗效显著。

4.3 治疗妇科疾病围绝经期综合征病机为肾气渐衰、阴阳失衡[50],龟甲胶补肾气,滋阴潜阳[51],治疗围绝经期综合征疗效显著。邱明英等[52]用龟鹿补肾丸(龟甲胶、鹿角胶、淫羊藿、续断、狗脊、菟丝子等)治疗功能性无排卵症,有效率为86.6%,成功受孕率为60.0%。此外,龟甲胶还可以辅助治疗慢性盆腔炎、功能失调性子宫出血、卵巢早衰等[53-56]妇科疾病。

4.4 治疗其他疾病龟甲胶的临床应用十分广泛,除了能够治疗以上疾病外,与其他中药配伍还可用于更年期失眠、阿尔兹海默病、贫血、抑郁症、癌症等疾病的治疗中[57-61]。

5 讨论

随着现代研究技术和方法的发展,龟甲胶在炮制和提取工艺方面有了新的进展,主要成分、药理作用以及临床应用方面也有了新的发现,但目前仍存在较多问题,建议如下:①拓宽药源途径。胶类中药需求量较大,药源紧张、价格昂贵,中华草龟是唯一的药用物种来源,闭壳龟、巴西龟、鳄龟、海龟等其他品种均不能作为龟甲的药用资源,一定程度上限制了龟甲胶的药源途径。因此,可在做好质量控制、药效研究的基础上,利用其他龟科动物为原料,拓宽龟甲胶的药源途径;②提高鉴别技术。龟甲胶真伪难辨,黄明胶、猪皮胶以及杂皮胶等均可冒充龟甲胶,应提高市场胶类药材鉴别技术。首先把控好动物源,应用光谱法快速检测,高效液相色谱法做定量分析;其次测定龟甲胶与其他类似饮片中的标志蛋白和多肽,以作为龟甲胶的特征性因子,应用荧光定量 PCR、DNA条形码等新兴技术建立胶原蛋白特征肽段检测方法,为龟甲胶的专属性鉴定提供新的方法;③加强研究力度。龟甲胶的化学成分多为蛋白质、氨基酸和微量元素,但药效物质基础并不明确,应继续应用现代科学技术对其进行实验研究,阐明其药效基础,为药物研发及临床应用提供科学依据;引入质量标志物概念,基于新的质量评价标准建立具有动物药材特色的质量评价体系。