角膜晶状体蛋白醛脱氢酶分类和功能的研究进展

任沐晨 何宇茜 王淑荣 张妍

角膜作为眼球最前端的透明的非血管组织，在引导外部光线至眼部，并抵御紫外线、入侵的微生物和环境毒素等外界刺激方面有着重要作用。就引导外部光线至眼部而言，醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）作为角膜晶状体蛋白参与了角膜折光系统的组成。就抵御由紫外线引起的氧化应激反应而言，角膜形成了以代谢酶和小分子形式存在的强大的抗氧化剂防御系统，ALDH便是防御系统中重要的一环。ALDH通过其代谢特性、伴侣活性和抗氧化剂还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[Reduced nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate)，NAD(P)H]的生成来避免紫外线辐射（Ultraviolet radiation，UVR）诱导的损伤[1]，减轻角膜氧化应激反应，进一步维持角膜透明度和折射率。此外，ALDH还参与角膜细胞分裂分化的调节，在维持不同物种角膜的稳态方面发挥着不可替代的作用。随着ALDH在角膜结构、细胞活动、氧化应激等方面的研究日益受到重视，ALDH与眼病的关系也逐渐成为眼科焦点。尽管其相关机制目前尚不十分清楚，但对ALDH更深入的研究可能为未来临床眼病的治疗提供新的思路和更有效的靶标。笔者将对ALDH在角膜中的分类、功能及临床应用前景进行综述。

1 ALDH作为角膜晶状体蛋白的起源、种类及表达位置

角膜晶状体蛋白为具有代谢功能的多种胞质蛋白，显示分类群特异性并在透明角膜组织中有高水平积累，其晶状体蛋白的多样性源自晶状体蛋白基因启动子内多个独立形成的Pax6/PaxB结合位点的融合进化。现已证实调节ALDH1A3、ALDH3A1[2]和X-crystallin/ALDH1A9合成的基因都受Pax6调控[3]。尽管原始ALDH基因是否也受到Pax6/PaxB的调控这一问题仍不明确，但经实验验证Pax6/PaxB和ALDH之间的直接联系符合“插层进化”假说。ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3中的PaxB在眼的形成和进化中是视黄酸代谢中的重要酶，而视黄酸是控制眼发育的关键因素。在晶状体进化之前，ALDH基因对于最原始眼的形成已经非常重要，并且可以扩展到它与角膜晶状体蛋白相关的功能。

一个原始ALDH基因通过多次基因复制，扩展为一个多基因家族。目前已知的ALDH类角膜晶状体蛋白种类已达24种。ALDH的第一个公认的角膜晶状蛋白是同源二聚体ALDH3A1，其最初被鉴定为是牛眼角膜中的一种特定抗原（牛角膜54-kDa蛋白）。迄今为止，研究人员已在人类中发现20个醛脱氢酶超家族的基因，在真核生物中发现24个[4-5]。ALDH1、ALDH2和ALDH3家族的成员在脊椎动物和无脊椎动物的角膜中以分类群特异性方式高度表达。ALDH3A1存在于人类、牛、猪、小鼠、大鼠、狒狒等大多数哺乳动物的角膜中，主要在角膜上皮、角膜基质细胞中表达，占角膜晶状体蛋白的5%～50%[6]。ALDH1A1是另一种常见的角膜晶状体蛋白，存在于人以及兔子、鸡、青蛙、鳟鱼等脊椎动物的角膜中。在人类角膜中，ALDH1A1主要分布于角膜上皮和基质层，约占角膜总可溶性蛋白的3%[1]。ALDH1A1兔子、鸡、青蛙和鳟鱼等脊椎动物也在角膜中大量表达[7-8]。在兔角膜中，ALDH1A1分别占上皮、基质层和内皮总可溶性蛋白的3%、16%和11%。ALDH2存在于鸡、鳟鱼和斑马鱼等动物角膜中[4]，主要在角膜上皮细胞和基质层细胞中表达，其表达水平与ALDH1A1的表达水平相当[9]。ALDH家族中在眼部发现的还有ALDH1A8、ALDH1A9、ALDH1C1/2等，均由角膜细胞合成[10]。

2 ALDH功能的研究进展

ALDH主要在维持角膜的结构、调节细胞周期、减轻角膜氧化应激反应和减轻自由基对角膜伤害等方面起作用。结构方面，ALDH作为光学元件参与维持角膜透明性、减少入射光的散射并维持角膜折射率；细胞周期方面，ALDH参与调节角膜细胞的增殖与分化；减轻角膜氧化应激反应方面，ALDH可减少脂质过氧化，避免角膜蛋白酶体失活或降解；减轻自由基对角膜伤害方面，ALDH可对UVR进行直接吸收并协助角膜的抗氧化剂功能。

2.1 ALDH是角膜结构要素的一部分

ALDH作为角膜晶状体蛋白维持着角膜透明结构。Chen等[11]为了评估ALDH3A1和ALDH1A1对角膜光散射特性的影响，将小鼠分为3组进行实验：ALDH3A1基因单敲除小鼠、ALDH1A1基因单敲除小鼠和ALDH1A1、ALDH3A1基因双敲除小鼠，研究结果发现小鼠角膜有少量散射，并且在9 个月后所有小鼠均出现白内障症状，这与蛋白酶活性降低和氧化蛋白增加有关[11]。此外，小鼠和大鼠出生后9～14 d，尤其是在它们睁开眼时，ALDH3A1的含量迅速增加，并且Torricelli和Wilson[12]与Raghunathan等[13]研究发现兔角膜伤口愈合过程失调易形成基质混浊或瘢痕，伴有角膜晶状体蛋白ALDH3A1、ALDH1A1表达降低，光散射增加，并产生结构紊乱、不透明的细胞外基质。Meek和Knupp[14]研究表明，ALDH3A1和ALDH1A1极大地提高了角膜组织的透明度和折射能力，证实了ALDH是角膜光学元件的组成部分。

2.2 ALDH调节角膜细胞的增殖与分化

ALDH3A1抑制角膜上皮细胞和角膜成纤维细胞的增殖，使细胞具有更长的倍增时间，更长的细胞周期长度和更低的集落形成效率。Koppaka等[15]在实验中建立了Tet-On人角膜上皮细胞系，该系表达四环素诱导的野生型或催化失活的ALDH3A1。实验观察到人角膜上皮细胞的增殖速率随ALDH3A1的表达而降低，与不表达ALDH3A1蛋白的细胞相比，这些细胞的种群倍增时间延长，同时伴随着铺板效率的降低和DNA合成减少。细胞周期蛋白A，B，E，E2F和p21 被下调，细胞周期蛋白依赖性激酶活性也降低。在体内角膜伤口愈合模型中，ALDH3A1的表达在损伤后立即下调，与损伤部位周围的基底细胞的活性增殖期一致。实验结果表明ALDH3A1抑制角膜细胞的增殖。同时，在另一组小鼠角膜中，仅在ALDH1A1、ALDH3A1基因双敲除小鼠中注意到细胞增殖加快，这表明ALDH1A1 可以在一定程度上抵消ALDH3A1的抗增殖效果。ALDH蛋白之间可能存在相互作用。此外，角膜中的ALDH1A1 可以通过氧化ALDH3A1的底物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）来补偿ALDH3A1[16]。

ALDH3A1还可调节角膜上皮分化[17]。在高钙浓度下生长的永生化人角膜上皮细胞系中，ALDH3A1表达改变了一组角膜分化标志物的mRNA转录水平，并可通过其酶活性进行调节。此外，ALDH家族的ALDH1A1，ALDH1A2，ALDH1A3，ALDH1A7和ALDH8A1中的PaxB是在眼的形成和进化以及视黄酸代谢过程中的重要酶[18]，可催化视黄醛不可逆地转化为视黄酸，后者通过调节类维生素A信号的传导在发育过程中起关键作用，是控制眼发育的关键因素[19]，可与视黄醛共同调控基因表达，减弱上皮细胞向鳞片状分化，增加上皮生长因子受体的数量。它与和DNA连接及调控基因表达有关的受体结合，可调节上皮组织的导向分化。

准分子激光角膜切削术后或角膜移植失败后发生混浊、瘢痕化或冻伤角膜病变区的角膜细胞中，ALDH所占比例会明显下降[20-21]。临床应用姜黄素可明显减轻角膜基质细胞纤维化程度，随着姜黄素质量浓度的增加，ALDH mRNA表达量增加，对角膜基质细胞增生的抑制率逐渐增加，在术后修复中起到抑制角膜瘢痕生成的作用[22]。此外，Yusof等[23]的实验发现富含洋槐蜜的培养基中角膜细胞醛脱氢酶的基因表达较高，可促进离体角膜细胞增殖，证实了角膜细胞中的ALDH可被洋槐蜜保留用以对抗角膜瘢痕形成和促进角膜伤口愈合。ALDH的这一特性为研发促进角膜伤口愈合的潜在天然产物奠定了基础。角膜晶状体蛋白在对抗角膜瘢痕形成，促进角膜伤口愈合中有重要作用，为药物研发提供了新思路。ALDH3A1等醛脱氢酶的表达可能有助于角膜再生。有研究发现，牙周膜中含有干细胞分化后的角膜基质细胞表达ALDH3A1等标志物，有助于角膜再生[24]。

2.3 ALDH减轻角膜氧化应激反应

氧化应激与脂质膜的氧化降解有关，也称为脂质过氧化。此过程会产生200多种醛，其中许多具有高反应性和毒性。对于产生的活性氧和不间断积累引起的脂质过氧化反应产生的数百种醛，ALDH3A1可进行代谢，减轻氧化应激并促进角膜细胞中DNA氧化损伤的修复[25-26]。Voulgaridou等[26]建立了稳定表达人ALDH3A1 基因的HCE-2 细胞系，分别用不同氧化剂处理后发现表达ALDH3A1 的细胞均具有较低的ROS水平，证实了其极强的抗氧化保护作用。此外，HCE-2 细胞系中大多数与DNA损伤信号转导（DNA damage signaling，DDS）相关蛋白的基因表达被上调，说明ALDH3A1 可能通过改变特定DDS相关基因的表达来维持DNA完整性，从而维持角膜稳态。ALDH可减轻糖尿病大鼠眼组织的脂质氧化损伤，在预防糖尿病相关性眼部并发症发生方面发挥一定的作用[27-29]。

ALDH超家族包含NAD（P）+依赖性酶，可将多种内源性醛和外源性醛氧化为相应的羧酸。在数百种醛中，最具代表性的醛是4-羟基-2-壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE），它在细胞中可以使蛋白酶体失活或降解。受损蛋白质的积累将对角膜透明性产生不可逆的不良影响。ALDH3A1 的表达抑制了促进4-HNE加成的蛋白质的形成，从而避免了4-HNE诱导的细胞毒性和凋亡。ALDH3A1转染的细胞对4-HNE 诱导的细胞毒性具有更高的抵抗力[30]。ALDH1A1 也可代谢4-HNE和MDA[31]。ALDH3A1和ALDH1A1 保护细胞免受4-HNE的不利影响。以乙醇为例，乙醇主要被乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化成乙醛，后主要被ALDH2 进一步氧化成乙酸。ADH和ALDH都需要的辅助因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）被转化为还原形式NADH[32]，这个过程可能导致NAD+/NADH失衡引发线粒体功能受损，会促进ROS的形成并增强氧化应激反应，进而引发脂质过氧化并产生反应性醛如4-HNE，会诱导蛋白质和DNA的共价修饰[33]。在人类20种ALDH同工酶中，ALDH2是乙醇衍生乙醛代谢最有效的酶[34-35]。在ALDH2过表达小鼠中的研究表明，增强ALDH2活性可以减轻乙醇乙醛的毒性，修复氧化应激引起的角膜急性或慢性损伤[36-37]。ALDH1A1 和ALDH1B1 也对这一过程有贡献，ALDH1A1能够将视黄醛氧化为视黄酸[38]，还能代谢乙醇代谢物乙醛和脂质过氧化物的主要产物等。屈光手术中酒精法去上皮会影响角膜上皮紧密连接的修复，在压陷式眼压计接触角膜时，乙醇消毒后，并未彻底挥发干净，此时也会造成部分角膜上皮灼伤、剥脱[39]。ALDH在这种情况下即可发挥作用，减轻角膜氧化应激反应。

2.4 ALDH保护眼部免受UVR诱导产生的自由基的伤害

UVR进入眼会带给眼球较严重的伤害，可导致链断裂、蛋白质交联以及嘧啶和胸腺嘧啶二聚体在DNA链中的形成。有研究显示UVR可以引起眼部炎症[40]，进一步的影响包括白介素-1的释放，单线态氧、超氧阴离子、羟基和过氧自由基的增加，都会导致氧化应激反应，最终将造成光化性角膜炎、白内障、黄斑变性等眼部疾病。

在眼最前部角膜处ALDH对抵御UVR具有重要作用，它们是抵抗紫外线辐射引起的眼组织损伤的细胞防御机制的重要组成部分。在Marchitti等[41]实验中，与对照组相比，高剂量紫外线照射（0.2 J/cm2）导致所有ALDH缺乏症小鼠出现严重的角膜水肿。ALDH抵御UVR的机制主要表现为以下4个方面：①ALDH可对UVR进行直接吸收[41]。在角膜中高度表达的ALDH3A1 会变性并被UVR灭活，这被视为一种变相的被动保护。②ALDH可清除氧化应激产物和衍生物。ALDH3A1的活性氧自由基清除作用是其抗氧化作用的体现[41]，可保护角膜免受氧化剂诱导的氧化和遗传毒性影响[26]。③角膜中失活蛋白ALDH3A1 的聚集还可防止晶状体内晶状体蛋白积聚诱发的白内障[6]。Lassen等[42]实验证明角膜中缺乏ALDH3A1可导致角膜中过氧化醛或其他ROS积累并进入晶状体造成晶状体混浊。角膜中的ALDH3A1、ALDH1A1可能通过过滤紫外线及时代谢UVR诱导产生的氧化物，避免在角膜中积累的醛扩散到晶状体中，保护了晶状体免受环境引起的氧化损伤，降低了白内障发病率。④作为分子伴侣的ALDH3A1可产生抗氧化剂NAD（P）H协助角膜的抗氧化剂功能。蛋白酶体是负责清除受损蛋白质的主要蛋白质水解系统[43]，ALDH3A1可修饰其活性来阻止UVR引起的氧化损伤。作为一种新型分子伴侣，ALDH3A1在保持活性酶的还原能力的同时，还可促进其他新合成蛋白的稳定并加快其折叠变性[6]。在Voulgaridou等[44]研究中，ALDH3A1在4 ℃高温下可保护柠檬酸合酶免受热失活。

3 ALDH的实验应用与肿瘤治疗

ALDH作为角膜实验中必不可少的检测指标参与了多项研究[1,42,45-47]。ALDH可作为静息角膜基质细胞的分子标记参与实验结果检测。角膜处于伤口愈合过程中或离体培养基中时，存在的血清或生长因子会激活角膜基质细胞转化为成纤维细胞和成肌纤维细胞，ALDH蛋白不再表达，失去角膜基质细胞的功能，这对于将离体角膜细胞掺入基于细胞的治疗中以维持正常的角膜透明度和功能至关重要。ALDH3A1 也可作为判断角膜上皮细胞是否处于增殖状态的一个标志。由于ALDH3A1 的表达与细胞增殖速率之间呈反比关系，在活跃增殖的人原代角膜上皮细胞中，ALDH3A1基因逐渐丧失表达，而在ALDH3A1稳定表达的人角膜上皮细胞则显示出生长减慢、细胞周期延长。ALDH在检测角膜基质细胞形态和发炎状况中也起着重要作用。在培养的圆锥角膜基质细胞中发现ALDH明显减少，而圆锥角膜正与角膜炎症状态有关[45]。此外，ALDH也充当评估角膜信号传导通路的标志物。在探讨慢性史蒂文斯-约翰逊综合征（Stevens-Johnson syndrome，SJS）中类维生素A代谢基因表达的改变的实验中，Srividya等[47]通过ALDH1A1的表达量评估患者维甲酸受体信号传导中视黄酸受体的基因表达情况。有关ALDH在调节角膜稳态中新作用的见解可最终转化为针对角膜病理学如干眼症、角膜损伤、基于感染引起的角膜瘢痕、角膜混浊和白内障[48-49]等更有效的治疗干预措施，奠定了探索与晶状体蛋白相关的眼病病理生理机制的基础，并为其临床应用提供了潜在的治疗靶标。

目前对角膜中ALDH的研究方兴未艾，但很多临床应用都处于研究阶段，较为有限，ALDH的肿瘤治疗为研究重点。ALDH活性是癌症干细胞的重要特征[50]，在这些细胞中ALDH的表达有助于消除氧化应激并赋予癌细胞对化学治疗剂（如草氮磷，紫杉烷和铂类药物）的抗性[51]。ALDH是多种肿瘤的治疗靶标[52]，如针对胶质母细胞瘤和结直肠细胞中的重要靶标ALDH1A3、ALDH1A3的选择性竞争性抑制剂可体外抑制癌细胞的生长侵袭[53]。我们也期待角膜晶状体蛋白ALDH这一充满潜力的研究课题取得更多突破性进展。

4 小结

ALDH作为角膜晶状体蛋白对角膜、晶状体和视网膜在保持结构和功能方面都是必不可少的，其可维持角膜透明性、调节细胞周期、抵御UVR、抗氧化应激、降低白内障发病率和抑制角膜瘢痕生成，在维持角膜稳态中发挥着重要作用。随着对ALDH的不断研究，对ALDH超家族的研究会更加深入。更前沿地了解与ALDH相关的眼部疾病发病机制可为角膜疾病、晶状体疾病等的预防和治疗方面提供新的研究思路。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明任沐晨：收集数据；参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文。何宇茜：参与选题、设计及资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论。王淑荣：资料的分析与解释，修改文中关键性结论。张妍：主持选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结论