酵母菌0939-5产挥发性抑菌物质固态发酵工艺优化

李华静,王晓东

(1.石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室,新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意义】灰霉孢菌(Botrytiscinerea)是引起果蔬采后真菌性病害的主要病原菌之一。其中,由灰霉孢菌引起的灰霉病是导致葡萄产量和质量下降的最主要病害[1]。使用化学药剂控制葡萄采后病害方法较陈旧[2-3]。近年来,利用拮抗微生物控制果蔬采后病害是替代化学杀菌剂的新方法[4-5]。其中拮抗酵母受到关注[6]。利用拮抗酵母制成生防菌剂对控制葡萄果实采后病害防治有实际意义。【前人研究进展】应用于生防菌剂的制备有液态发酵或者固态发酵两种方式,但液态发酵培养基的水分多,产生的废液也多,易受污染且成本较高[7-8]。而固态发酵与液体发酵相比成本低、产物浓度高、能耗少且应用广泛。田晓丽等[9]研究表明,生防放线菌153以麦麸为基本基质,并在麦麸中添加适量的玉米粉和小米粉分别作为碳源和氮源,可显著提高产孢量。俎延喜等[10]研究表明,当生防菌34-9发酵温度为30℃。发酵时间32 h,接种量15%,料水比1∶ 1时,可显著提高生物量。酵母及其产生的挥发性有机物(Volatile organic compounds, VOCs)在拮抗果蔬采后病害过程中发挥重要作用[11-13]。利用不同VOCs控制植物病害已有研究[14-16]。Gabler[17]的研究证实,在葡萄的包装内放置Muscodoralbus熏蒸物能够有效阻止葡萄灰霉的发生,对控制葡萄储藏运输过程中的腐烂变质是一种行之有效的方法。黄蓉[18]研究表明,假丝酵母C410产生的挥发性产物能够抑制某些真菌,对草莓灰霉病具有显著的抑制效果。【本研究切入点】酵母菌株0939-5是由课题组前期筛选出的一株生防菌,该菌株能产生挥发性抑菌物质,且前期试验表明该菌株对葡萄灰霉病病菌具有显著抑菌作用。需将这一菌株发展为一种生物熏蒸剂。【拟解决的关键问题】以酵母菌株0939-5为研究对象,分析该菌株的固体发酵和生产工艺,为将其研发成高效、安全、环保的微生物熏蒸剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

酵母菌株0939-5和葡萄灰霉病菌菌株伊63-2由石河子大学农学院植保系提供。两种供试菌株分别接种在PDA平板中,0939-5置于26℃恒温培养箱中培养2 d后待用;伊63-2放入25℃恒温箱中培养3 d后,获取新鲜灰霉菌丝,备用。

1.2 方 法

1.2.1 酵母菌株0939-5产挥发性抑菌物质固态培养基质的筛选

采用双皿相扣的方法对酵母菌株0939-5产挥发性抑菌物质测定葡萄灰霉病菌的抑菌活性。称取淀粉、大米粉、糯米粉、小米粉、小麦粉、玉米粉、燕麦粉和黄豆粉各15 g,分别放入编号为A直径9 cm的培养皿内,121℃灭菌20 min,取出冷却后,接入2 mL 1×108CFU/mL的酵母菌悬浮液,且加少量无菌水,搅拌均匀,使初始含水量30%。取另一相同直径的培养皿B,倒入PDA,冷却后接入直径7 mm灰霉菌菌株伊63-2菌饼。去除A、B培养皿皿盖后,B皿倒扣在A皿上,用封口膜密封后,置于25℃恒温培养箱内培养5 d后,观察B皿中灰霉菌的生长状况,测量菌落的半径。以B皿为对照。每个处理设3个重复。

1.2.2 营养成分对酵母菌株0939-5产挥发性抑菌物质活性的影响

1.2.2.1 碳源及其浓度筛选

由1.2.1筛选获得的最适基质为基本固体培养基质,分别加入葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉,使其终浓度为2%,以不加碳源的基质为对照。测定最适碳源方法同1.2.1。筛选获得最佳碳源后,分别设定其浓度为0%、2%、4%、8%和16%(M/M),同上法测定最适碳源浓度。试验固体培养基质初始含水量为30%。每处理设3次重复。

1.2.2.2 氮源及其浓度筛选

分别选取氯化铵、硝酸钾、尿素和胰蛋白胨加入含有最适碳源浓度的基本固体培养基质中,终浓度为1%。氮源及其浓度的筛选具体方法同1.2.2.1。以不加氮源的基质为对照。最适氮源的浓度设定为 0.5%、1%、2%、4%和8%(M/M)。每处理设3次重复。

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1.2.2.3 无机盐及其浓度筛选

分别选取硫酸镁、氯化钾、氯化锰和碳酸钙加入含有最适碳、氮源的基本固体培养基质中,终浓度为0.3%。无机盐及其浓度的筛选具体方法同1.2.2.1。以不加无机盐的基质为对照。最适无机盐的浓度设定为0.01%、0.05%、0.1%、0.2%(M/M),每处理设3次重复。

1.2.3 培养条件对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

以上法筛选获得的固态发酵基质,分别设置酵母菌接种浓度为0.5×107、1×107、2×107、0.5×108、1×108和2×108CFU/mL;初始酵母接种量为0.5%、1%、2%、5%、10%、15%和20%;初始pH为3、4、5、6、7、8和10及初始含水量为10%、20%、30%、40%、50%和60%。具体测定方法同1.2。每处理设3次重复。

1.3 数据处理

数据利用 Microsoft Excel 进行处理,采用SASS 23.0 统计软件中的方差分析程序分析差异显著性。比较处理之间的差异采用 Duncan 氏新复极差法(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株0939-5产挥发性抑菌物质固态发酵基质的筛选

研究表明,酵母菌株0939-5在8种供试固态基质中均能产生挥发性抑菌物质且对葡萄灰霉菌的生长具有明显抑制作用。其中玉米粉、小麦粉、黄豆粉、燕麦粉的抑制效果最好,其抑菌圈半径分别为35.08、34.91、34.75和34.66 mm,且基质间差异不显著,但与其他4种基质的抑制效果之间存在显著差异。淀粉的抑菌活性最低,抑菌圈半径为30.41 mm。图1

2.2 固体基质营养成分对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

2.2.1 碳源及其浓度对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

注:图柱上部不同小写字母表示差异显著(P<0.05),以下图相同

图2 不同碳源下酵母菌株0939-5产

2.2.2 氮源及其浓度对对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

研究表明,4种氮源及对照组对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性均有不同程度的影响。胰蛋白胨最有利于提高酵母菌0939-5产挥发性物质抑菌活性,抑菌圈半径为32.17 mm,且与其它氮源产挥发性物质抑菌活性间差异不显著。图4

图3 不同葡萄糖浓度下酵母菌株0939-5

图4 不同氮源种类下酵母菌株0939-5

2.2.3 无机盐及其浓度对对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

研究表明,4种无机盐及对照组对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性均有不同程度的影响。当添加无机盐为硫酸镁时抑菌圈半径最大,且有利于提高酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性,抑菌圈半径为25.54 mm,且与氯化钾间产挥发性物质抑菌活性差异不显著,其抑菌圈半径分别为25.42 mm;与氯化锰和碳酸钙产挥发性物质抑菌活性之间存在显著性差异,抑菌圈半径分别为15.59和11.75 mm。不同浓度的硫酸镁均对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性有影响,0.1% MgSO4的抑菌圈最大,为37.42 mm,0.2% MgSO4的抑菌圈最小,为36.25 mm,且与MgSO4抑菌圈存在显著性差异。图5,图6

图5 不同无机盐种类下酵母菌株0939-5

图6 不同硫酸镁浓度下酵母菌株0939-5

2.3 固体基质发酵条件对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

2.3.1 接种浓度对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

研究表明,接种浓度在0.5×107～1×108CFU/mL,酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性随着接种浓度的增加,抑菌圈半径呈上升趋势,在接种浓度为1×108CFU/mL时达到最大,为39.00 mm,且与2×108CFU/mL间差异不显著,抑菌圈半径为38.58 mm;与0.5×107、1×107和2×107CFU/mL存在显著性差异,抑菌圈半径分别为35.83、37.00和37.92 mm。当接种量大于1×108CFU/mL时,酵母菌株0939-5抑菌圈半径呈下降趋势。图7

图7 不同接种浓度下酵母菌株0939-5

2.3.2 初始酵母接种量对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

研究表明,随着接种量的增加,菌株的抑菌圈半径整体呈上升趋势,在接种量为10%时,达到最大,为32.67 mm,且与接种量15%和20%的抑菌圈半径间差异不显著;与接种量0.5%、1%、2%和5%的抑菌圈半径间存在显著性差异,抑菌圈半径分别为10.01、21.67、29.26和28.26 mm。图8

图8 初始酵母接种量下酵母菌株0939-5

2.3.3 固态发酵基质初始pH对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

研究表明,固体基质酸碱度对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性具有不同程度的影响。当pH4时,酵母菌株0939-5的抑菌圈半径最大,为39.00 mm,且与其他pH值相比,存在显著性差异。pH值为3时,酵母菌株0939-5产挥发性抑菌物质活性最低,抑菌圈半径为37.00 mm。图9

图9 初始pH下酵母菌0939-5

2.3.4 初始含水量对酵母菌株0939-5产挥发性物质抑菌活性的影响

研究表明,培养基固体基质中含水量在10%～40%时,随着固体基质中水分含量的增加,菌株的抑菌圈半径也在逐渐增加。初始含水量为40%时,菌株0939-5抑菌圈半径最大,为36.38 mm,与含水量20%、30%和50%处理组间差异不显著,抑菌圈半径分别为34.71、35.92和34.88 mm;且与含水量10%和60%处理组间存在显著性差异,抑菌圈半径分别为25.96和28.88 mm。当含水量大于40%时,随着含水量的增加,菌株的抑菌圈半径逐渐下降。图10

图10 初始含水量下酵母菌株0939-5

3 讨 论

固态发酵与传统的深层发酵相比,具有许多优点,包括提高产量、降低能耗、易于产品提取、设备空间小、减少微生物污染等。更容易恢复[19-21]。固体发酵是利用易获取且价格低廉的农副产品及其废弃物作为发酵基质,筛选利于真菌生长的最佳基质作为发酵底物,同时水分含量、接种量、温度等因素也会影响菌体的生长[22]。王春艳等[23]通过单因素试验筛选出放线菌LG-9的最佳固态发酵底物为小米时,可以获得较好的发酵结果。以玉米粉为固态发酵基质,添加4%葡萄糖、无蛋白胨、0.005%硫酸镁、0.1%磷酸二氢钾,5%接种量、培养48 h的条件下,布拉酵母菌与凝结芽孢杆菌能够以最佳的生长状态生长[24]。由于不同的微生物菌株所需的生长条件不同致使固态发酵时的培养条件也有所差异,任加庆等[25]通过单因素试验发现在所筛选的培养基成分中,当接种量为1.2×106CFU/mL、含水量40%、pH4、培养周期为8 d、吐温-80含量1%时,在各自组内产生的孢子数最多。不同菌株的最优发酵条件不同,每种菌株都有其特有的生长需求。选择适合菌株生长的最佳固态发酵基质和最佳培养条件,可以得到较好的发酵结果,且有利于提高所需菌体的产量,使菌体以最佳生长状态生长[22]。研究仅采用单因素法进行筛选,未对多因子相互作用对酵母菌株0939-5产挥发性物质的影响作进一步深入研究。

4 结 论

通过单因素筛选及培养条件的优化,获得以当玉米粉为固态发酵基质,分别加入2%葡萄糖和0.1%硫酸镁;同时接入1×108CFU/mL酵母菌株0939-5悬浮液,接种量为10%;基质初始pH为 4,初始含水量为40%,酵母菌 0939-5产挥发性抑菌物质对葡萄灰霉病菌抑制作用最佳。