景观植物白粉病重寄生菌的调查及分离方法

唐晓雪,孙 璘,哈孜拉·赛依里罕,李文丽,董沛竺,任毓忠,,李国英

(1.石河子大学农学院,新疆石河子 832003;2.新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室,新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】白粉病是气传病害,植物在感染白粉病后,叶片表面被白色粉状霉斑覆盖,影响植物的光合作用,造成植株早衰,导致产量和品质受损[1,2]。目前有多种措施防治白粉病,生物防治已是一种重要防治措施[3]。白粉病是危害植物生长、影响植物经济价值的病害之一,白粉寄生孢(Ampelomycesquisqualis)是一种寄生在白粉菌上的重寄生真菌,研究景观植物白粉病重寄生菌、筛选分离培养基,对白粉病的生物防控有重要意义。【前人研究进展】重寄生是生物学的特殊寄生现象,是一种微生物又寄生在其他微生物上的现象[4-5]。白粉寄生孢(Ampelomycesspp.)是白粉病菌上常见的重寄生菌,其针对白粉病菌有严格的寄生性,且对其所寄生的白粉菌无特异的选择性,寄生范围较广,对控制植物白粉病有一定效果。已开发出多种防治白粉病的生防制剂,如:AQ10、Q-fect、POWDERYCARE、Green Biotech和AgriLife等[6]。【本研究切入点】我国对白粉寄生孢的分离鉴定、生物学特性及其互作等方面已有研究,但应用白粉寄生孢防治白粉病的研究还未见报道[7]。另外,由于白粉寄生孢具有生态的适应性,需开发适合当地环境的菌株,才能更有针对性效防治当地的白粉病。新疆是我国白粉病发病较严重的区域,而对白粉寄生孢的研究和开发利用鲜见报道[8-11]。需丰富关于白粉寄生孢的信息资料,针对新疆石河子地区景观植物上白粉菌重寄生菌的寄生情况进行调查。【拟解决的关键问题】研究白粉寄生孢在当地景观植物上的重寄生状况,分析白粉寄生孢的分离方法,为白粉寄生孢的种类确定、生防潜能的评价及生防菌株的开发利用奠定理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

调查时间为2020年9月中旬至10月下旬,田间白粉病发生后期。调查地点为石河子市公路两旁、公园以及明珠河公园的绿化区,调查对象主要为感染白粉病的落叶乔木、草本和灌木类花卉或绿化植物等18种观赏植物。

以石河子地区每种调查对象种植区域为一个采样点,每个采样点的植物上随机采集感染白粉病的植物叶片,每点至少10张叶片,所采取叶片正面白粉病粉状霉斑覆盖率在60%以上。采集后叶片分别用密封袋隔离装袋,带回实验室内自然风干后待用[12-13]。

1.2 方 法

1.2.1 白粉寄生孢寄生状况

在解剖镜下观察每个点采集的感染白粉病的不同植物叶片,确定是否有白粉寄生孢的寄生。白粉寄生孢寄生的主要表现为,白粉菌的分生孢子、菌丝、分生孢子梗上存在棕褐色白粉寄生孢的分生孢子器[14-16],观察到叶片有白粉寄生孢褐色分生孢子器存在的区域认定有重寄生的发生。白粉寄生孢在田间的自然寄生状况的评价以被白粉寄生孢寄生面积占叶片上白粉菌侵染面积的百分率分级[12-13]。

0级:白粉菌上没有白粉寄生孢寄生;

1级:被白粉寄生孢的寄生面积在10%以内;

2级:被白粉寄生孢的寄生面积占11%～25%;

3级:被白粉寄生孢的寄生面积占26%～50%;

4级:被白粉寄生孢的寄生面积51%～100%。

白粉寄生孢寄生程度计算方法参考McKinney[13]。确定每种植物白粉病上的白粉寄生孢的寄生普遍率和寄生指数(RAmpelomyces)。

式中,RAmpelomyces表示白粉病被白粉寄生孢的寄生指数,Σ(c×d) × 100 中c为所收集检查叶片中各寄生级别的叶片数;d为各级别的代表值;N为所检查的叶片总数;4为分级标准的最大值。

1.2.2 白粉寄生孢的分离

1.2.2.1 分离

分离用的材料为被白粉寄生孢寄生的荷兰菊白粉病叶片,分离用培养基为改良的PSA培养基(PSA+20 g/L麦芽提取物),制备好的培养基121℃灭菌20 min待用;使用前加入浓度为50 mg/L氯霉素用于抑制细菌的生长[17-20]。分离方法有(1)直接挑取分离法[21]:将供试的荷兰菊白粉病病叶放置在解剖镜下观察,用灭菌挑针直接挑取叶片上的白粉寄生孢单个分生孢子器,转移至分离培养基上;(2)水琼脂过滤改良挑取法:先将解剖镜下观察到的白粉寄生孢分生孢子器用灭菌挑针转移至1%的水琼脂培养基(WA)上,再将水琼脂平板置于解剖镜下,用挑针把分生孢子器上的杂质及多余的菌丝剥离,粘在水琼脂培养基表面,最后将分生孢子器重新转移至改良的PSA培养基上。每皿接10个分生孢子器,平板背面在接菌处用记号笔画圈做标记,每种方法4次重复,分离后将平板置于25℃光暗交替(12 h/12 h)培养箱中培养,每隔1 d观察1次,记录白粉寄生孢和杂菌的生长状况,7 d后观察统计,计算不同分离方法的分离率和污染率。

1.2.2.2 分离用培养基筛选

分离培养基筛选的材料为被白粉寄生孢寄生的同一区域采集的荷兰菊白粉病叶片,供试培养基6种,分别为察氏固体培养基(Czapek-Dox)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA),以及分别加入20 g/L麦芽提取物的改良PDA(PDA+M)、PSA(PSA+M)和察氏(Czapek+M)培养基;分离方法采用1.2.2.1所描述的水琼脂过滤挑取法,每种培养基以1皿为一个重复,每皿接10个白粉寄生孢分生孢子器,在皿底接种的部位画圈标记,重复4次。后将平板置于25℃光暗交替(12 h/12 h)培养箱中培养,分离后7和14 d用十字交叉的方式测量菌落直径[17],观察记录不同培养基的分离率与菌落直径。

1.3 数据处理

数据分析通过MicrosoftExcel及SPSS应用程序处理完成。

2 结果与分析

2.1 白粉寄生孢的寄生特征

研究表明,石河子地区景观植物在9月中旬后白粉病发生较为普遍,病菌感染叶片、叶柄、花以及茎秆。光线充足时,肉眼可见病叶片表面的白粉菌颜色暗沉并有消退的迹象病叶在解剖镜下观察,部分白粉病菌上有明显寄生现象,除了叶片正面大量寄生外,叶背面、叶柄及茎秆的发病处也有白粉寄生孢寄生,花器部位白粉病发病一般较轻,无明显寄生状况;白粉寄生孢的分生孢子器在白粉菌上常成片聚集分布,极少有单个分生孢子器单独出现;9月中旬白粉寄生孢分生孢子器偏圆润且饱满,10月下旬分生孢子器略瘦长。

自然寄生状态下的白粉寄生孢分生孢子呈棕褐色,表面油亮具光泽,形状多样,多数呈梭形或柠檬形,部分鸭梨形还有少数为饱满的唇形,叶片久置风干后,分生孢子器颜色呈棕褐色稍暗,没有光泽,不饱满,明显干瘪。以蒸馏水为浮载剂,将白粉寄生孢的分生孢子器挑在载玻片上,用体式显微镜观察单个分生孢子器,表面有不规则网纹,基部有短柄,顶部有或无乳突,大小为(32.4～79.2) μm×(35.6～49.5) μm,壁薄,易破裂,渗出半透明分生孢子;分生孢子单孢,长椭圆形或卵圆形,两端具油球,大小为(7.3～9.0) μm×(3.0～4.5) μm。图1

注:A:田间白粉病消退症状; B:白粉寄生孢自然条件下寄生状况;C:白粉寄生孢分生孢子器;D:分生孢子

2.2 白粉寄生孢的寄生

研究表明,白粉寄生孢在石河子地区观赏植物白粉菌上的寄生较普遍,平均寄生普遍率和寄生指数分别为56.69%和28.52,但不同植物白粉病上的白粉寄生孢寄生程度存在较明显差异。其中荷兰菊、蛇鞭菊、黑心金光菊、百日菊白粉病上白粉寄生孢的寄生程度较高,其分生孢子器的分布和数量较多,寄生率分别为92.86%、92.86%、66.67%和85.71%,平均为84.52%,寄生指数分别为49.58、41.43、45.71和37.62,平均40.92;被寄生后的白粉病菌菌丝或分生孢子颜色暗黄色,无光泽,有轻微的消退迹象。白粉寄生孢对黄刺玫、穗花婆婆纳、车前草、长药八宝、大花金鸡菊白粉病的寄生程度次之,寄生率分别为51.54%、73.33%、71.43%、51.55%和68.43%,寄生指数分别为39.62、36.67、30.71、30.56、30.26,分生孢子器的分布和数量相对较少,叶片表面的白粉菌没有明显变化;白粉寄生孢寄生率较低的是金银花、苜蓿、丁香、石竹、月季白粉病;对于白榆、夏橡、刺槐等乔木植物白粉病的寄生程度相对较低,寄生指数均低于20,且叶片上白粉寄生孢分生孢子器的分布和数量很少,且叶柄及茎秆上几乎观察不到白粉寄生孢的分生孢子器;薄荷的病叶及茎秆上均无白粉寄生孢寄生的现象。表1

表1 石河子地区景观植物白粉寄生孢状况

2.3 白粉寄生孢分离方法

2.3.1 不同分离方法对白粉寄生孢分离效果的影响

研究表明,采用直接挑取法分离时,白粉寄生孢分生孢子器表面附着大量菌丝体和杂质,由于白粉寄生孢生长极其缓慢,在接种2～4 d时,培养基上还未观察到白粉寄生孢的特征菌落,接种位点和周围已经出现污染菌菌落,其中主要为链格孢霉菌、青霉、曲霉和细菌,污染菌生长速度明显快于白粉寄生孢,导致污染菌快速占领白粉寄生孢周围的培养基空间,从而使白粉寄生孢无法正常生长,使得纯化的难度增大,14 d后白粉寄生孢被杂菌覆盖,几乎不可见。采用优化挑取法分离白粉寄生孢时,在接种1～4 d时,培养基表面无明显变化,杂菌出现的情况极少,一般为青霉菌污染,在5～7 d时培养基上陆续出现白色至米黄色突起的小点,排列密集,气生菌丝发达,呈绒球状,即为白粉寄生孢的菌落,剔除周边的杂菌,可一次性得到纯净的菌株。表2

表2 不同方法下白粉寄生孢的分离变化

优化挑取法与直接挑取法分离白粉寄生孢的分离率分别为90%和30%,2种方法之间存在极显著的差异(P<0.01),优化挑取法的分离率远高于直接挑取法;优化挑取分离法杂菌的污染率大大低于直接挑取法分离法,直接挑取法杂菌52.5%,而优化挑取法几乎没有杂菌的污染。通过将白粉寄生孢的分生孢子器在水琼脂培养基表面黏附过滤后,再转移至分离培养基上,可以提高白粉寄生孢的分离率,有效获得白粉寄生孢的纯培养物。

2.3.2 不同培养基对分离的影响

研究表明,白粉寄生孢在供试的6种培养基上均会产生特征性的菌落,但不同培养基上出现明显菌落的时间存在明显差异,接种7 d时,PDA、Czapek+M、PDA+M和PSA+M培养基上产生明显的特征性菌落,分离率在92.5%～95.0%;Czapek与PSA培养基上未出现白粉寄生孢菌落。接种14 d时,供试的6种培养基上均有白粉寄生孢的特征性菌落出现,分离率在90.0%～95.0%,不同培养基间分离率没有明显的差异;白粉寄生孢在6种供试培养基上均能生长。

白粉寄生孢在供试6种培养基上的生长速度存在显著差异,白粉寄生孢在PSA+M和Czapek+M培养基上的生长速度最快,菌落直径平均分别为7.83和7.77 mm,其次为PDA+M培养基,菌落直径为6.58 mm;白粉寄生孢在PDA、PSA和Czapek培养基上生长速度较缓慢,菌落直径分别为2.81、1.36和1.27 mm,且在培养基上菌丝稀疏。

在真菌分离培养常用的Czapek、PDA、PSA培养基中加入2%的麦芽提取物可以有效改善白粉寄生孢生长速度,菌落直径比不添加麦芽提取时分别增加了6.12、2.34和5.76倍(平均4.74倍)。在分离白粉寄生孢时,最好在培养基中加入适量的麦芽提取物,可有明显提高分离的成功率。表3

表3 不同培养基下白粉寄生孢分离变化

3 讨 论

通过对石河子地区景观植物白粉病重寄生菌的调查,发现在采集的18种植物白粉菌叶片中有17种上都观察到了白粉寄生孢的重寄生。寄主植物和宿主白粉菌对白粉寄生孢的寄生程度都有明显的影响,菊科植物白粉病菌菊苣高氏白粉菌(G.cichoracearum)上白粉寄生孢的重寄生状况最为普遍[18-21]。以王凯涛等[22]2019年对石河子地区花卉白粉病的调查及花卉白粉病的病原鉴定为依据,此次调查显示,白粉寄生孢对不同属白粉病菌的寄生程度存在明显的差异。白粉寄生孢寄生率较高的白粉菌有高氏白粉菌属(Golovinomyces)的菊苣高氏白粉菌(G.cichoracearum),平均寄生指数为43.59;白粉寄生孢对单囊壳属(Podosphaera)的P.fusca、P.pannosa和P.fuligine等3个种的寄生程度次之,白粉寄生孢的平均寄生指数为32.89;白粉寄生孢对白粉菌属(Erysiphe)不同种的寄生程度相对较低,除小二孢白粉菌E.biocellata上未观察到寄生外,其余6种白粉菌被白粉寄生孢的平均寄生指数为23.34。与赵福云[8]等以及孔涛等[23]报道菊科植物与蔷薇科植物上白粉寄生孢重寄生结果一致;另外植物的生长环境条件对白粉寄生孢的分布也有一定影响,例如调查中发现,田间低矮的草本植物更容易被白粉寄生孢寄生,而大型乔木上白粉寄生孢寄生较少;在温室大棚中采集的番茄、辣椒、甜菜、月季、四叶草白粉病的病叶上未观察到白粉寄生孢自然寄生的现象。

通过对荷兰菊上白粉寄生孢的分离表明,14 d内在供试的6种分离培养基上白粉寄生孢的分生孢子器均能形成菌落,分离率均在90%及以上;添加了20 g/L麦芽提取物的Czapek、PDA和PSA培养基对白粉寄生孢的菌落生长有良好的促进作用,菌落直径明显大于未添加麦芽提取物的同类型基础培养基。

对分离白粉寄生孢常用的直接挑取法进行改良,即将白粉寄生孢的分生孢子器先在水琼脂培养基表面进行杂菌剥离,再转移至PSA+M分离培养基上,可以明显提高白粉寄生孢的分离成功率,并可以有效减少杂菌的侵染覆盖,降低菌株纯化难度。

白粉寄生孢作为防治白粉病的生防菌之一,但其在植物感染白粉病的初期自然重寄生程度较低,且白粉寄生孢传播较慢,因此在自然条件下该菌对白粉病的控制作用不明显。通过调查筛选,分离出寄生范围广,活性强的菌株或通过基因改良技术来提高白粉寄生孢防治效果,将其应用于白粉病的发病初期,才能有利于抑制白粉病的扩展蔓延。目前还缺少关于重寄生真菌对于杀菌剂的抗性及对干旱、低温和高温等胁迫的耐受性研究,需要对许多生物因素和非生物因素进行广泛的研究,以提高白粉寄生孢的生物防治潜力。

4 结 论

白粉寄生孢在石河子地区景观植物白粉病上寄生情况较为普遍,检出率达94.4%,其中菊科植物白粉病菌菊苣高氏白粉菌(G.cichoracearum)上最易被寄生,平均寄生普遍率和寄生指数分别为84.52%和40.92。叶片、叶柄及茎秆病部可观察到白粉寄生孢的分生孢子器,其分布多聚生(少散生),表面有不规则网纹,基部有短柄,顶部有或无乳突,大小为(32.4～79.2)μm×(35.6～49.5) μm;分生孢子单孢,长椭圆形或卵圆形,两端具油球,大小为(7.3～9.0) μm×(3.0～4.5) μm。分离过程中采用水琼脂过滤的改良方法挑取分生孢子器分离率达90%以上,添加了麦芽提取物的PSA和Czapek培养基可有效提升白粉寄生孢的生长速率,增幅分别为5.76倍和6.12倍。