柽柳根际土壤放线菌的分离及拮抗活性筛选

陈乙煌,邢 利,东珍珍,马小梅,黄建军,罗晓霞

(1.塔里木大学生命科学学院,新疆阿拉尔 843300,2.新疆阿拉尔市十三团农业发展服务中心,新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】放线菌是农业生态系统中防治病虫害的重要微生物资源[1-2]。塔里木盆地在干旱极端环境下孕育着具有耐旱抗盐的荒漠植物。柽柳是新疆植被中的主要物种之一,主要分布在塔里木盆地,挖掘柽柳土壤微生物资源,对于新疆主要农牧业病害的防控及保护和利用新疆极端环境放线菌资源具有重要意义。【前人研究进展】张金辉等[3]从阿勒泰福海县周边柽柳根际土样中分离得到的噬盐糖多孢菌A-064对番茄早疫病菌等具有较强抑制作用。【本研究切入点】以柽柳根际土壤为材料,分离柽柳根际放线菌[4-5],以细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)、解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylohydrolytic)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi),以及植物病原真菌白色念珠菌(Candidaalbicans)、链格孢(Alternariatenuissima)、棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)为靶标菌进行拮抗活性放线菌生物筛选。【拟解决的关键问题】选择新疆南疆地区10种柽柳根际土壤的放线菌资源,采用四种培养基,研究新疆塔里木盆地放线菌资源代谢产物的多样性,为农牧业病害防治提供更多药物先导化合物的生产菌株。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤样品

采集新疆南疆地区10种不同地点的柽柳根际土壤样品于无菌样品盒子中,置于4℃保存,备用。表1

表1 土壤样品信息

1.1.2 供试靶标菌

以革兰阳性细菌代表种S.aureus,E.coli,P.aeruginosa,K.pneumonia,E.amylohydrolytic,S.typhi,C.albicans,A.tenuissima,V.dahliae,F.oxysporum为靶标菌保存于新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室。

1.1.3 培养基

(1)高氏一号培养基[6];(2)5号培养基:蛋白胨5 g,酵母提取物1 g,柠檬酸铁0.1 g,NaCl 19.45 g,MgCl25.9 g,Na2SO43.24 g,CaCl21.8 g,KCl 0.55 g,NaHCO30.16 g,KBr 0.08 g,SrCl234 mg,H3BO322mg,硅酸钠 4 mg,NaF 2.4 mg,NH4NO31.6 mg,Na2HPO48 mg,琼脂16 g,蒸馏水1 L,pH 7.0～7.5;(3)8号培养基:可溶性淀粉10 g,燕麦片10 g,(NH4)2SO42 g,K2HPO41 g,MgSO41 g,NaCl 1 g,CaCO32 g,微量元素溶液 1 mL,琼脂 16 g,蒸馏水 1 L,pH 7.2;(4)甘油精氨酸培养基[7];(5)TSB液体培养基[8];(6)MHA(MHB)培养基用于细菌的培养和拮抗活性筛选[9];采用SDA(SDB)培养基用于白色念珠菌的培养和拮抗活性筛选[9];(7)OA(OB)培养基用于链格孢的培养和拮抗活性筛选[10];(8)PDA(PDB)培养基用于棉花枯黄萎病菌的培养和拮抗活性筛选[11]。

1.1.4 主要仪器

PCR 仪:SENSO,德国;凝胶成像仪器ChemDoc XRS+:伯乐公司,美国;超净工作台SW-CJ-2F:博迅,上海;电泳仪DYCZ-26C:六一仪器厂,中国;电热恒温水浴锅DHP-9272:一恒,上海;离心机Centrifuge 5415 D:Eppendorf,德国。

1.2 方 法

1.2.1 根际土壤放线菌的分离

称取1 g土壤样品置于9 mL无菌的生理盐水,充分振荡混匀,即为10-1土壤悬浊液;依次稀释10倍,采用倍性稀释法分别配置成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6土壤悬浊液。以不同区域样品为材料,采用iChip[12]技术,选取高氏一号培养基,5号培养基,8号培养基,甘油精氨酸培养基进行放线菌的分离培养[13-17],以上培养基中加入重铬酸钾,放线菌酮,萘啶酮酸和制霉菌素以抑制细菌和霉菌的生长,于28℃恒温培养箱中倒置培养3～20 d,分离到的放线菌[13-14]经纯化培养,收集于20%甘油中,在-80℃冷冻保存。

1.2.2 柽柳根际土壤菌株的鉴定

采用CTAB法提取放线菌的基因组DNA,以基因组DNA为模板,以27F和1 492R为引物,引物序列27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR扩增,送样测序。将测序后的16S rDNA序列提交到EzBiocloud(http://www.ezbiocloud.net),对16S rDNA 进行相似性比对搜索,判断菌株种类。选取相似序列,到NCBI的blast(Basic Local Alignment Search Tool,序列对比工具) 工具比对,分析菌株的相似性,使用MEGA 7.0[18],选择GenBank中与之同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列,以塔里木大学菌株排序为编号构建菌株 Neighbor- Joining系统发育树进行系统发育分析。

1.2.3 拮抗活性筛选

分离的放线菌划线培养制成菌饼备用。(1)细菌活性筛选:将靶标菌接种至MHB液体培养基中,37℃,180 r/min摇床培养8 h,吸取菌液加入到 MHA培养基中,混匀倒板。将分离的放线菌菌饼分别接入,置于37℃培养箱中培养18 h。(2)真菌活性筛选:靶标菌为白色念珠菌,棉花黄萎,链格孢时分别用SDA,PDA,OA培养基培养,分别接种至液体培养基中,28℃,180 r/min摇床培养72 h,将靶标菌菌悬液涂布培养,接入菌饼,置于28℃培养箱中培养72 h。观察其抑菌活性及计算抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 柽柳根际土壤菌株的分离

研究表明,共分离获得放线菌294株,不同地点的柽柳根际土壤样品分离的放线菌数量有明显不同,HT51柽柳根际土壤样品分离的菌株最多,共有118株;HT49柽柳根际土壤样品次之,共有89株;HT53柽柳根际土壤样品和HT65柽柳根际土壤样品最少,0株。

甘油精氨酸培养基分离出的菌株最多,共有119株;其次是高氏一号培养基,共有80株;5号培养基最少,共有33株。甘油精氨酸培养基和高氏一号培养基较适合分离其根际土壤放线菌。图1

注:A:不同土壤样品分离的菌株数量;B:不同培养基分离的菌株数量

2.2 柽柳根际土壤菌株的鉴定

研究表明,柽柳根际土壤菌株分属于7个纲12个目16科24个属,24个属分别是链霉菌属(Streptomyces)、小单胞菌属(Micromonospora)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、微杆菌属 (Microbacterium)、无色杆菌属(Achromobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、产碱杆菌属 (Alcaligenes)、副根瘤菌 (Paramesorhizobium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、沙门氏菌 (Salmonellaenterica)、从毛单胞菌属(Comamonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、新根瘤菌(Neorhizobium)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、纤维菌属(Cellulosimicrobium)、香味菌属(Myroides)、博代氏杆菌属(Bordetella)、叶状杆菌属(Phyllobacterium)、普罗维登斯菌属(Providencia)、居海绵粉色杆状菌(Roseivirga)、剑菌属(Ensifer)。除链霉菌以外的稀有放线菌包括小单孢菌,微杆菌和纤维菌属。图2

注:A:16S rDNA电泳图 B:16S rDNA序列扩增电泳图(M:为maker,P为阳性,N为阴性)

鉴定的150株菌株中,有9株相似度小于98.65%,为潜在新物种。将9个潜在新物种归属于3个属,分别是Paramesorhizobium,Streptomyces,Pseudonocardia等3个属的潜在新物种。其中TRM 76038与ParamesorhizobiumdesertiA-3-E相似性98.26%,为Paramesorhizobium;TRM 76037与StreptomycescoeruleorubidusISP 5145相似性98.06%,为Streptomyces;TRM 76012与ParamesorhizobiumdesertiA-3-E相似性97.89%,为Paramesorhizobium;TRM 76006与StreptomycesalbogriseolusNRRL B-1305相似性98.59%,为Streptomyces;TRM 76011与StreptomycesgossypiisoliTRM 44567相似性97.43%,为Streptomyces;TRM 76023与StreptomyceslongispororuberNBRC 13488相似性98.64%,为Streptomyces;TRM 76246与Pseudonocardiazijingensis6330相似性98.65%,为Pseudonocardia;TRM 76249与StreptomycesasenjoniiKNN 35.1b相似性98.26%,为Streptomyces;TRM 76070与StreptomycesniveoruberNBRC 15428相似性98.51%,为Streptomyces。图3

图3 基于16S rDNA序列构建柽柳根际

2.3 柽柳根际土壤放线菌的拮抗活性筛选

研究表明,对E.coli有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101对E.coli的抑菌作用最强,抑菌圈达到17 mm;对S.aureus有拮抗活性菌株有8株,TRM 76185和TRM 76130对S.aureus病原菌的抑制作用最强,抑菌圈直径达到18 mm;对P.aeruginosa有拮抗活性菌株有11株,TRM 76072对P.aeruginosa的抑制作用最强,抑菌圈直径达到20 mm;对K.pneumonia有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101对K.pneumonia的抑制作用最强,抑菌圈达到16 mm;对E.amylohydrolytic有拮抗活性菌株有9株,TRM 76187对E.amylohydrolytic的抑菌作用最强,抑菌圈达到16 mm;对S.typhi有拮抗活性菌株有11株,TRM 76101对S.typhi的抑菌作用最强,抑菌圈达到16 mm;对C.albicans有拮抗活性菌株13株,TRM 76101对C.albicans的抑菌作用最强,抑菌圈达到22 mm;对A.tenuissima有拮抗活性菌株有47株,TRM 76177对A.tenuissima的抑菌作用最强,抑菌圈达到25 mm;对V.dahliae有拮抗活性菌株有16株,TRM 76156对V.dahliae的抑菌作用最强,抑菌圈达到30 mm;对F.oxysporu有拮抗活性菌株有12株,TRM 76159对F.oxysporu的抑菌作用最强,抑菌圈20 mm。筛选的150株柽柳根际土壤放线菌中,具有抗菌活性的放线菌有68株,约占鉴定总数的46%。表2

3 讨 论

3.1对分离的294株菌株经初步排重后,筛选后链霉菌为优势类群,与夏占峰等[19]潘文娟等[20]所得的结果相符。选用了V.dahliae等为靶标菌,可以运用当地微生物资源去解决当地农作物生产过程中所遇到的植物真菌感染问题。

3.2对于不同靶标菌的抑制,柽柳根际土壤的放线菌对A.tenuissima有抑制作用的数量最多,对V.dahliae病原菌有抑制作用的放线菌数量其次。菌株来源不同,对病原菌的抑制作用也会有不同,表现出土壤样品种类和地域方面的差异,与王婧等[21]所得结果相符合。TRM 76063和TRM 76033虽然16S rDNA基因序列相似性都是99.56%,但是其抑菌活性差异又很大,在拮抗活性筛选时,不同土壤样品的同一物种的菌株,活性也会不同,即为同一物种的菌株活性有差异。

4 结 论

从采集的的柽柳根际土壤样品中分离并鉴定出150株土壤放线菌,其属于7个纲12个目16科24个属,另有9个潜在新种,以金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,大肠杆菌,肺炎克雷伯菌,解淀粉欧文氏菌,伤寒沙门氏菌,白色念珠菌,链格孢菌,棉花黄萎病菌,棉花枯萎病菌为靶标菌,筛选出68株活性放线菌。