26个鲜食枣品种SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析

张雁飞,苏比娜·肖克来提,杨 磊,郝 庆,靳 娟,樊丁宇

(1.新疆农业科学院园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测实验站,乌鲁木齐 830091;2.新疆农业大学园艺学院,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】枣(ZiziphusJujubaMill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(ZiziphusMill.)植物,原产中国[1]。枣具有良好的生态和经济效应,适应性广,已育成800多个枣树品种[2]。但枣树品种和类型命名较混乱,尤其是在同音异义词和同义词的使用上。鲜食枣品种冬枣有20多个不同的地方名称。需要建立一套准确鲜食品种鉴定方法。【前人研究进展】农作物的品种鉴定方法主要包括生化鉴定法、物理化学鉴定法、形态学鉴定法和DNA分子标记法[3]。前3种鉴定方法耗时长,且易受环境因素的影响;而运用DNA分子标记法来进行种质和品种鉴定,具有快速、高效和准确的优点[4]。SSR(Simple sequence repeat,简单重复序列)广泛分布于真核生物基因组中[5],因其高多态性、共显性、稳定性和适于自动化分析等特点,被广泛应用于种质资源保护、遗传多样性分析、亲缘关系研究、遗传作图、DNA指纹分析和分子标记辅助育种等领域[6]。麻丽颖等[7]利用从冬枣中开发的12对SSR引物,分析36份枣种质,构建了36份枣品种的指纹图谱,为枣树分类、种质鉴定和分子育种提供了重要的工具。原勤勤等[8]分析38份枣树品种遗传多样性,其多态性比率为88.47%。殷晓等[9]利用SSR标记分析了陕北54份枣种质的遗传结构,在分子水平上研究陕北枣品种群遗传结构表明,陕北枣属于中度杂合,遗传多样性丰富,供试品种交流频繁,遗传多样性与品种间亲缘关系之间有密切的联系。江锡兵[10]、艾呈祥[11]等利用SSR分子标记对栗杂交F1代进行了遗传多样性分析,多样性指数为0.881 6～1.131 7,其子代均有丰富的遗传多样性。【本研究切入点】对各类枣树鉴定的相关研究已有很多,但未有专为鲜食枣品种鉴定的方法总结,需研究种质为保存于新疆的26份鲜食枣种质资源,通过该试验来构建枣品种DNA指纹图谱。【拟解决的关键问题】研究利用22对SSR引物构建26份鲜食枣种质资源指纹图谱,分析其遗传多样性,为鲜食枣品种鉴定和遗传多样性分析提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

26份鲜食枣品种资源保存在新疆叶城果树科学观测实验站枣资源圃。采集26个枣品种的幼嫩叶片,利用改良CTAB方法提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳及微量分光光度计检测质量和浓度,并将样液保存于-20℃冰箱待用。表1

表1 26份鲜食枣品种名称及产地来源

22对SSR引物序列由北京林业大学林木育种国家工程实验室庞晓明课题组开发提供,由上海派森诺基因科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 SSR-PCR扩增体系

利用三引物法PCR(即在5′端加有M13 尾巴序列的特异正向引物、特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13 引物,利用毛细管电泳技术可以同时检测不同荧光染料标记的多个SSR 位点)扩增SSR 位点。

SSR-PCR反应为20 μL体系,包含1 μLDNA 模板,各1 μL 正反向引物,2 μL 10*Buffer,0.5 μL dNTP, 0.5 μLTaq酶,14 μL ddH2O。

PCR 扩增程序按以下步骤进行:首先95℃预变性5 min;其次95℃变性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环10次;随后95℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环25 次;最终72℃延伸7 min。PCR产物中加入LIZ 500与HiDi内标,震荡充分混匀,瞬离以除去管壁样品;经95℃变性4 min后迅速移至冰上冷却,放置于ABI 3730 XL全自动DNA测序仪内进行毛细管电泳检测,用Gene-Marker软件(Soft Genetics LLC,USA)进行数据分析。表2

表2 SSR引物信息

1.2.2 指纹图谱构建

参考麻丽颖等[7]方法构建指纹图谱。以所分析的SSR引物名称为前缀,该标记在某样品上扩增带的分子量为后缀,得到每个品种在某个标记的带型编号。按照固定的引物排序综合不同引物分析结果,串联各带型编号,形成该品种的SSR指纹图谱。

1.3 数据处理

依据凝胶结果同一位置有无条带进行赋值,有条带赋值记为“1”,无条带则赋值记为“0”,根据赋值在Excel中建立26份材料的 “0-1”矩阵。计算不同群体的等位基因数(Allele number,Na)、有效等位基因数(Effective number of allele,Ne)、Shannon’s 信息指数[12](Shannon’s information index,I)和观察杂合度(Heterozygosity,Ho)等进行对比分析,计算引物多态性信息含量(Polymorphism information content,PIC)[13]。通过NTSYS软件进行遗传相似性分析并计算遗传相似系数(Genetic identity,GI)和遗传距离(Genetic distance,GD)。采用UPGMA(非加权配对法)聚类分析,在树状图中构建26份枣品种之间基于遗传相似性的遗传关系。

2 结果与分析

2.1 毛细管电泳结果

研究表明,利用22对SSR引物对26份枣品种进行多态性分析。22对SSR标记在26个品种中共扩增出130条等位片段,平均每对引物能扩增到5.909个,其中BFU1279和BFU0308扩增的等位基因数最多,为10个;BFU0263和BFU0614扩增的等位基因数最少,为2个。各引物的多态信息含量(PIC)变幅为0.237 7～0.855 6,平均为0.59。平均每个位点观测等位基因数(Na)为5;有效等位基因数(Ne)为3.776;杂合度(Ho)为0.927;Shannon信息指数(I)为1.371。表3

表3 22对SSR引物多态性信息及其遗传参数

2.2 指纹图谱构建

研究表明,3对SSR引物组合(BFU00308、BFU1157和 BFU0547)就可以将26份枣品种完全区分开。其中引物 BFU0308和BFU1157的区分能力最强,多态位点数分别达10和9个,可以区分京沧6号、京沧8号、赛蜜酥1号和迎秋红等26个品种。表4

表4 26个枣品种的SSR指纹图谱

2.3 聚类分析

研究表明,26份枣品种的遗传相似系数在0.65～1.00,平均相似系数为0.83。在遗传相似系数0.65处可将26个品种分为两大类。第一大类包括24个品种,其中秦820(8)与早冬1号(11)相似系数最大,2个品种之间有很近的亲缘关系;依次亲缘关系较近的迎秋红(10)和京39(22),京沧8号(6)和阜帅(7)之间的遗传相似系数为0.97;玉娇(2)、懒汉冬枣(25)、圆铃2号(20)和赛蜜酥1号(5)都与金丝小枣(S26)聚成了一个小类群;ZS9和雨帅也聚在了一个小类群内,遗传相似系数达到0.86,2品种之间的亲缘关系近;第二大类包括两个品种,金芒果枣(15)和美蜜枣(24)与其它 24个品种的遗传相似系数都比较低,在0.6左右,与其他品种具有较远的亲缘关系。图1

图1 26个红枣品种的聚类

3 讨 论

SSR(简单重复序列)和单核苷酸多态性(SNPs)已经成为植物遗传分析和标记辅助育种的主要标记[14-16]。然而,对于研究较少的植物,如枣树,开发SNPs的成本很高,目前只有几个SSR标记被报道为阐明遗传多样性的优越分子工具[17-18]。SSR分子标记具有高多态性和重复性,共显性遗传等优势。研究所用的22对SSR分子标记是经过筛选获得的多态性引物,具有较强的区分能力,在各品种中均表现出清晰的多态性带型,可用于基因型分析并构建指纹图谱。使用3个引物便可准确鉴别出26个枣品种,品种间遗传相似系数在0.65～1.00。Li等[19]利用一组59个SSR标记对1 863个地方品种的遗传多样性和遗传分化进行了分析。麻丽颖等[7]构建了36份枣种质的SSR指纹图谱,为枣树品种鉴定和分子育种提供了重要工具。张春梅等[20]利用5对SSR引物鉴定了黄河沿岸的50个不同酸枣样品的遗传相似性和群体结构,为酸枣种质资源保存和利用提供了依据。殷晓等[21]对陕北不同区域8个品种群的54份种质资源进行了SSR分子标记分析并研究了品种群间的遗传关系,揭示了枣品种群分化及枣种质在起源地的亲缘关系。

DNA指纹图谱技术在植物种质鉴定方面具有重要的作用。研究通过毛细管电泳筛选出的22对核心引物对26份枣品种(系)进行了指纹图谱的构建和UPGMA聚类分析。根据各品种的特征谱带数据其中的3对特定引物(BFU0308,BFU1157和BFU0574)可将26个品种完全区分开,通过SSR DNA分子标记可以构建较理想的枣品种DNA指纹图谱,在枣品种鉴定研究中具有重大意义。毛细管电泳毕其他电泳法相比具有成本低和减少排废污染等优点[22]。但有一些SSR标记应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来验证,避免检测出一些非目标PCR扩增产物。

4 结 论

共扩增出130条等位片段,平均5.909个。多态信息含量(PIC)变化范围为0.237 7～0.855 6,平均为0.59。22对SSR引物的杂合度介于0.500～1.000,平均为0.927。3对引物BFU0308,BFU1157和BFU0574组合能完全区分26个枣品种。26个品种遗传相似系数在0.65～1.00,相似系数0.65处可将26个品种分为两大类群。