千金藤素基于Akt/mTOR通路诱导宫颈癌细胞自噬

郭 洁,李 晶,汤丽丽,刘 蓉

1.邯郸市第一医院妇三科,邯郸 056002;2.邯郸市第一医院纺医院麻醉科,邯郸 056002

宫颈癌为女性第二常见恶性肿瘤[1]。在宫颈癌发生、发展及治疗中,细胞自噬发挥着重要作用[2]。自噬为真核生物细胞内普遍存在的现象之一,一方面能满足细胞代谢及某些细胞器更新的需要,另一方面也可诱导细胞出现自噬性死亡,可能成为肿瘤治疗中促进肿瘤细胞凋亡的靶点[3]。千金藤素为传统中药千金藤的活性成分,是一类异喹啉类生物碱,具有抗炎、调节免疫、稳定质膜及抗肿瘤等药理学作用[4]。研究显示[5-6],千金藤素在口腔鳞状细胞癌、胆管癌及肺癌等多种恶性肿瘤的治疗中发挥作用,可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。本研究重点分析了千金藤素对宫颈癌细胞自噬的作用,并探讨其相关机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LVEM5型台式投射电子显微镜(美国Delong Instruments公司);SpectraMax M3型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司);Gel Doc XR型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 试药

千金藤素(质量分数≥98%,上海源叶生物科技有限公司);四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法试剂盒(美国Biovision公司);吖啶橙(acridine orange,AO)染色试剂盒(美国Sigma公司);实时荧光定量分析(real-time fluorescence quantitative analysis,RT-PCR)试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司);二奎啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)蛋白试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司);兔抗人磷酸化丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(phosphorylated pyruvate dehydrogenase kinase 1,p-PDK1)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)一抗及山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗均购自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3 细胞

人宫颈癌HeLa细胞株购自中科院上海细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养、传代及分组

取人宫颈癌HeLa细胞株,以12 000 r·min-1离心10 min,离心半径为8 cm。置于含50 mg·L-1胎牛血清的DMEM/F12培养基中,在培养瓶内接种,在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养,生长至70%汇合度进行传代。取第3代处于对数生长期的HeLa细胞,密度调整为 1.0×104个·mL-1,在96孔板接种。细胞分为4组,千金藤素低剂量、中剂量及高剂量组分别以15、30、60 μmol·L-1千金藤素溶液处理24 h,对照组以等量生理盐水处理24 h。

2.2 细胞增殖活性检测

用MTT法检测。取2.1项下4组细胞,将细胞密度调整至1.0×104个·mL-1,在96孔板接种,复孔数均为5,另设空白孔,空白孔内仅加入培养液20 μL。各组培养24、48、72 h时,在孔内加5 mg·mL-1MTT溶液20 μL,置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。随后将各孔培养上清液清除干净,加入DMSO 150 μL,振荡8 min。待细胞内的紫蓝色结晶溶解后,用酶标仪检测,测定各组在490 nm波长处的吸光度值(A),评估细胞增殖活性。

2.3 细胞凋亡检测

用流式细胞仪检测。取2.1项下4组细胞,在96孔板内接种,复孔数均为5。观察细胞贴壁后,加入不含EDTA的胰酶消化。用EP管收集细胞,磷酸盐缓冲液冲洗。管内加 1×binding buffer 200 μL重悬细胞,在细胞重悬液内加入Annexin V-PE 5 μL,混匀,避光条件下孵育10 min。将7-AAD 5 μL加入各管,吹打混匀。以流式细胞仪检测各组细胞凋亡数量,计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=(凋亡细胞的数量/总细胞数量)×100%。

2.4 自噬溶酶体数量检测

用AO染色法检测。取2.1项下4组细胞,在24孔板接种,用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,以1 mg·L-1AO溶液染色15 min,避光,PBS清洗3次。镜下观察自噬溶酶体生成情况,无自噬溶酶体产生的细胞质在镜下呈绿色荧光,含自噬溶酶体者呈红色荧光。

2.5 自噬相关蛋白表达检测

用RT-PCR法检测。取2.1项下4组细胞,Trizol法提取总RNA,紫外分光光度计下检测吸光度,进一步逆转录生成cDNA。用GeneBank基因库内大鼠微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、Bcl-2同源结构域蛋白(Bcl-2 homologous domain protein,Beclin1)及p62基因序列,进行RT-PCR反应。反应体系为Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL ,上游引物1 μL,下游引物1 μL, cDNA 1.5 μL。反应条件为95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,30 s;72 ℃,10 min。共40个循环。引物设计为LC3-Ⅱ F(5′-AGAGAGGAGGTGAGCTGAGA-3′),R(5′-GAA-GGAGATGGAGACTAGGT-3′);Beclin1 F(5′-ACCACAGTTGAACAGTACCGCCGAAGTGTATG-3′),R(5′-ACAGTTGAGCCGAAGTGTATGGTACCA-CCACA-3′);p62 F(5′-TGTGAACCCTCGTCTTA-TCGC-3′),R(5′-AGGCGACTCACGGTCCTAAC-3′);β-actin F(5′-TACGATTCTCCCATCAACT-3′),R(5′-GTCTGGTAATCTCGCACTC-3′)。琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统分析电泳条带,以2-△△CT计算LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA的相对表达量。实验重复5次。

2.6 蛋白相对表达量检测

用蛋白质印迹法检测。取2.1项下4组细胞,PBS洗涤,加RIPA裂解液,制备匀浆,离心。考马斯亮蓝法进行蛋白定量检测,加2×上样缓冲液,沸水浴变性10 min。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后蛋白转移至PVDF膜,脱脂奶粉封闭1 h,洗膜。加兔抗人p-PDK1(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)及p-mTOR(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育过夜,洗膜。加山羊抗兔IgG二抗(1∶2 500),室温孵育,2 h,洗膜。Image Quant LAS4000生物分子成像仪显影曝光,检测蛋白的相对表达量,目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值。实验重复5次。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 细胞增殖活性

MTT实验细胞增殖活性各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.05);各组细胞增殖活性随培养时间延长逐渐升高(P<0.05)。与对照组比较,千金藤素3组细胞增殖活性降低,且高剂量组<中剂量组<低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组MTT实验A值比较

3.2 细胞凋亡率

细胞凋亡率各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,千金藤素3组细胞凋亡率升高,低剂量组<中剂量组<高剂量组(P<0.05)。见图1、表2。

注:A.对照组;B.千金藤素低剂量组;C.千金藤素中剂量组;D.千金藤素高剂量组。

表2 各组细胞凋亡率的比较

3.3 自噬溶酶体

对照组HeLa细胞内亮红色荧光比例较低,自噬溶酶体的数量较少,自噬程度低。与对照组比较,千金藤素3组亮红色荧光比例升高,自噬溶酶体的数量增多,自噬程度增强,低剂量组<中剂量组<高剂量组。见图2。

注:A.对照组;B.千金藤素低剂量组;C.千金藤素中剂量组;D.千金藤素高剂量组。

3.4 LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA的表达水平

LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA表达各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,千金藤素3组LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表达水平升高,p62 mRNA的表达水平降低,且比较LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表达水平,低剂量组<中剂量组<高剂量组;比较p62 mRNA的表达水平,高剂量组<中剂量组<低剂量组(P<0.05)。见表3。

表3 各组LC3-Ⅱ、Beclin1及p62 mRNA表达水平的比较

3.5 蛋白相对表达量

p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白相对表达量各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。

与对照组比较,千金藤素3组p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白的相对表达量降低,高剂量组<中剂量组<低剂量组(P<0.05)。见图3、表4。

图3 各组p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白表达比较

表4 各组p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白相对表达量的比较

4 讨论

宫颈癌是人乳头状瘤样病毒E6和E7蛋白与细胞癌基因、抑癌基因相互作用引发的一系列病理改变,导致细胞永生化而引发的癌变[7-8]。自噬与癌症进展有关,是一种内源性保护机制,主要是细胞经自噬体与溶酶体结合、对自身受损的细胞器和蛋白质进行降解的过程,近年来逐渐成为治疗癌症新的靶点[9]。中医古籍中没有宫颈癌病名,古代医家根据症状多将其纳入“崩漏”“癥瘕”及“五色带下”等范畴,该病属本虚标实之证,本为正气虚弱、冲任失调,标为湿热瘀毒凝结,治疗的关键包括抗癌解毒、活血化瘀、散结利湿、理气解郁等[10]。

千金藤属防己科植物,可清热解毒、疏风通络、祛风利湿,其有效成分千金藤素是一种天然生物碱,具有抑制细胞增殖、诱导细胞自噬及控制肿瘤细胞转移等抗肿瘤作用,且具有毒性低、价格低廉的优点[11]。项福英等[12]研究发现,千金藤素可通过调节相关信号通路诱导卵巢癌细胞自噬。邓琴等[13]提出,千金藤素能通过阻断自噬体与溶酶体的融合,发挥抑制乳腺癌细胞自噬体降解的作用。但目前千金藤素对宫颈癌细胞自噬的作用尚未完全阐明。本研究发现,用千金藤素处理后,宫颈癌HeLa细胞增殖活性降低、细胞凋亡率上升、自噬溶酶体的数量增多、自噬活性标志性蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA的表达水平升高、p62 mRNA的表达水平降低,并呈一定剂量依赖性,表明千金藤素可诱导宫颈癌HeLa细胞自噬、降低细胞增殖活性、促进细胞凋亡,其可作为治疗宫颈癌的潜在药物应用于临床。

细胞自噬受多种信号分子及信号通路调控,其中mTOR是与自噬相关的信号通路交汇节点,特别是Akt/mTOR信号通路对细胞自噬有一定负调控作用[14-15]。Akt/mTOR信号通路中核心蛋白mTOR的活化可影响自噬体的形成及成熟,该通路激活后可进一步激活下游mTOR的功能,发挥抑制细胞自噬作用[16]。李沫等[17]研究发现,PI3K/Akt/mTOR信号通路激活可能是抑制宫颈癌HeLa细胞自噬的重要作用机制之一。PDK1在多种肿瘤发生中有一定作用,靶向PDK1有望成为肿瘤治疗的重要手段[18]。研究显示[19],由PDK1介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路在多种癌症中发挥重要作用,且PDK1在大部分肿瘤细胞中呈高表达。还有研究表明[20],PDK1可激活PI3K/Akt信号通路,该通路可进一步激活mTOR,从而抑制细胞自噬的发生。这些研究提示,PDK1介导Akt/mTOR信号通路可能在宫颈癌细胞自噬中发挥一定作用。本研究结果显示,用千金藤素处理后,宫颈癌HeLa细胞p-PDK1、p-Akt、p-PI3K及p-mTOR蛋白的相对表达量降低,且效果呈一定剂量依赖性,表明千金藤素可抑制PDK1介导的PI3K/Akt信号通路,推测这是千金藤素诱导宫颈癌细胞自噬的重要作用机制之一。

综上所述,千金藤素可诱导宫颈癌HeLa细胞自噬、降低细胞增殖能力、促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PDK1介导的Akt/mTOR信号通路有关,但本研究并未就其他作用机制进行分析,存在一定不足,今后仍需进一步深入研究。