一测多评法在大柴胡颗粒质量评价中的应用

陈 辉,周婷婷,柏 倩

海安市中医院药剂科,海安 226600

大柴胡颗粒源于汉代张仲景《伤寒论》中记载的大柴胡汤,主要由柴胡、黄芩、大黄、枳实、芍药、半夏、大枣、生姜8味药组成,其中柴胡和黄芩为君药,大黄和枳实为臣药,芍药和半夏为佐药,大枣和生姜为使药。大柴胡颗粒是将大柴胡汤用现代制药工艺提取后经喷雾干燥制成的颗粒制剂,功效与大柴胡汤相同,具有和解少阳、内泻热结的功效[1]。临床常用大柴胡颗粒治疗因少阳不和和肝胆湿热所致的口苦、舌红苔黄腻、大便秘结、胆囊炎等[2-3]。此外,大柴胡颗粒对血糖、血脂和血压具有较好的调节作用,可有效缓解脑出血症状,减轻或消除肺部感染[4]。目前关于大柴胡颗粒有效成分含量测定的报道有限,并且《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)中尚无其质量标准的记载,因此继续完善大柴胡颗粒的质量标准对于提高其质量控制标准有重要意义。中药成分复杂多样,单一成分定量很难全面地进行质量控制,多组分定量则更为科学、可靠。一测多评法(quantitative analysis of multi-components by single-marker method, QAMS)基于中药成分内在函数及比例关系,用廉价、易得的对照品同时实现多种成分的定量控制,已逐渐被业内学者和制药工业认可,近年来已被用于多种中药的质量评价,而且被2020年版《中国药典》收载。QAMS不但适用于同类化合物(如黄酮类、皂苷类等)的质量控制[5],而且适用于不同种类化合物的质量控制[6-7]。本研究以黄芩苷为对照,用QAMS同时测定大柴胡颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的含量,为提高大柴胡颗粒的质量控制标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Alliance e2695型液相色谱仪、Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)色谱柱(美国Waters公司);Agilent-1260型液相色谱仪(美国Agilent公司);Thermo Ultimate 3000型标准双系统液相色谱仪、Thermo Hypersil GOLD(150 mm×4.6 mm,3 μm)色谱柱(美国Thermo Fisher公司);MS204TS/02型和XSE105DU型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司);TGL 16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药

对照品:柴胡皂苷B1(批号190621-009,质量分数为98.34%)、柴胡皂苷B2(批号58316-41-9,质量分数为99.6%),均购自成都德思特生物技术有限公司;汉黄芩素(质量分数>99.0%)、汉黄芩苷(质量分数>98.0%)、黄芩苷(质量分数>94.0%)、黄芩素(质量分数>97.0%),均购自中国食品药品检定研究院;甲醇为色谱纯;水为超纯水;磷酸等试剂均为分析纯。

大柴胡颗粒(批号:100103、110801、110802,精华制药集团股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别精密称定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2对照品适量,加甲醇配制成各对照品储备溶液(质量浓度均为1 mg·mL-1)。分别精密量取上述各对照品储备液适量,置于同一量瓶中,加甲醇稀释至刻度,配制成黄芩苷100 μg·mL-1、汉黄芩苷20 μg·mL-1、黄芩素5 μg·mL-1、汉黄芩素2 μg·mL-1、柴胡皂苷B12 μg·mL-1和柴胡皂苷B24 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取大柴胡颗粒细粉约1.0 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,加入10 mL体积分数为75%的甲醇,密塞,称定质量,超声,用体积分数为75%的甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过。吸取5 mL滤液,置于25 mL量瓶中,加体积分数为75%的甲醇至刻度,密塞,摇匀,滤过,将滤液离心,取上清液,经0.45 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。

2.3 阴性对照溶液的制备

除柴胡和黄芩外,其他药材按大柴胡颗粒原配方比例称取,按其生产工艺分别制成柴胡阴性样品颗粒(不含柴胡)、黄芩阴性样品颗粒(不含黄芩)以及黄芩和柴胡阴性样品颗粒(不含柴胡和黄芩),按照2.2项下的方法制备各阴性对照品溶液。

2.4 色谱条件

色谱柱为Waters XBridge C18柱。流动相为甲醇(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B),梯度洗脱(0～5 min,10% A;5～20 min,10%～45% A;20～45 min,45%～80% A;45～50 min,80%～90% A;50～52 min,90% A;52～55 min,90%～10% A;55～60 min,10% A)。流速为0.4 mL·min-1,检测波长为254 nm,柱温为35 ℃,进样体积为10 μL,分析时间为60 min。

2.5 专属性考察

取供试品溶液、对照品溶液和各阴性对照品溶液,按照2.4项下色谱条件测定。6个成分色谱峰均可达到基线分离,与相邻色谱峰分离度均>1.5,表明分离度良好,并且阴性对照溶液对测定无干扰。见图1。

注:1.黄芩苷;2.汉黄芩苷;3.黄芩素;4.汉黄芩素;5.柴胡皂苷B2;6.柴胡皂苷B1;A.供试品溶液;B.混合对照品溶液;C.黄芩阴性对照品溶液;D.柴胡阴性对照品溶液;E.黄芩和柴胡阴性对照品溶液;F.空白辅料对照品溶液。

2.6 精密度

精密吸取混合对照品溶液,按照2.4项下色谱条件连续进样6次,测定并计算6种成分的保留时间、相对峰面积及相对标准偏差(RSD)。黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2峰面积的RSD值分别为2.13%、1.23%、1.55%、1.68%、1.84%、1.95%,保留时间的RSD值分别为1.82%、1.25%、2.34%、1.46%、1.75%、2.21%,表明仪器的精密度良好。

2.7 线性范围考察

精密吸取2.1项下制备的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2对照品储备溶液适量,梯度稀释为6个质量浓度对照品溶液,按照2.4项下色谱条件测定各化合物的峰面积。分别以各化合物的质量浓度和峰面积进行线性回归,得到线性回归方程和相关系数,见表1。

表1 各成分的线性关系考察结果

2.8 重复性

取同一批大柴胡颗粒供试品6份,按照2.2项下的方法制备供试品溶液,按照2.4项下色谱条件进样,每份样品各进样1次,考察6种化合物的特征峰保留时间和峰面积,计算RSD值。计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的RSD值分别为2.12%、1.84%、1.56%、2.13%、2.25%、1.84%,保留时间的RSD分别为1.88%、1.64%、2.15%、1.84%、1.87%、2.29%,表明该方法的重复性良好。

2.9 稳定性

取大柴胡颗粒供试品1份,按照2.2项下方法制备供试品溶液,于0、4、8、12、24、36、48 h按照2.4项下色谱条件进样,考察6种化合物特征峰的保留时间和峰面积,计算RSD值。计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的RSD值分别为1.86%、1.59%、1.86%、1.88%、1.73%、2.07%,保留时间的RSD值分别为2.04%、1.75%、1.49%、1.93%、1.54%、1.79%,表明6种成分的溶液在48 h内稳定。

2.10 加样回收率

取已知黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2含量的大柴胡颗粒粉末约0.5 g,精密称定,共6份,分别精密加入黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2对照品,使所加入的对照品的质量和供试品中各成分的含量基本一致,按照2.2项下的方法制备供试品溶液,按照2.4项下色谱条件进样,测定和计算6种化合物峰面积的RSD值。结果显示,6种化合物的加样回收率在100.38%～102.00%范围内,6种成分的RSD值在1.29%～1.82%范围内,表明该方法的准确度良好。结果见表2。

表2 大柴胡颗粒中6种化合物的加样回收率结果 (n=6)

2.11 色谱峰定位的确定

2.11.1色谱峰定位 取2.1项下制备的混合对照品溶液,分别精密吸取不同体积(5、10、15 μL)分别进样3次,按照2.4项下色谱条件进样,以黄芩苷为内标,测定汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相对保留时间(Rt),取其平均值作为最终的结果。结果表明,汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相对于黄芩苷的相对保留时间分别为1.443、2.066、2.684、4.577、4.322,RSD值均≤2.33%,表明各化合物的相对保留时间波动较小。结果见表3。

表3 大柴胡颗粒中汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相对保留时间 (n=9)

2.11.2色谱峰定位的重复性考察 取2.1项下的混合对照品溶液,按照2.4项下色谱条件进样,分别考察Waters Alliance e2695型高效液相色谱仪、Agilent-1260型高效液相色谱仪和Thermo Ultimate 3000 型高效液相色谱仪3种高效液相色谱系统以及Waters XBridge C18和Thermo Hypersil GOLD对5种化合物色谱峰定位的影响。结果表明,汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相对于黄芩苷的相对保留时间分别为1.451、2.070、2.688、4.586、4.321,RSD≤2.38%,表明各化合物的色谱峰定位在不同的超高效液相色谱仪和不同色谱柱间具有良好的重复性。结果见表4。

表4 不同高效液相仪器和色谱柱下汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的相对保留时间 (n=6)

2.12 相对校正因子(RCF)的确定

2.12.1RCF的计算方法 取2.1项下制备的混合对照品溶液,分别精密吸取不同体积(5、10、15 μL)分别进样3次,按照2.4项下色谱条件进样,以黄芩苷为内标,测定汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2峰面积的RCF,取其平均值作为最终的结果。RCF=(Cs×Ak)/(Ck×As),Cs为参照物黄芩苷的质量浓度,As为参照物色谱峰的峰面积,Ck和Ak分别为汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的质量浓度和峰面积。结果表明,汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相对于黄芩苷的相对校正因子平均值分别为0.773、0.519、0.579、1.081、0.834,RSD值均≤1.33%,表明相对校正因子波动较小。结果见表5。

表5 大柴胡颗粒中汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2相对于黄芩苷的RCF (n=9)

2.12.2RCF的重复性考察 取混合对照品溶液,按照2.4项下色谱条件进样,分别考察Waters Acquity 超高效液相色谱仪、Eksigent Ekspert Ultra LC 100型超高效液相色谱仪和Thermo Scientific Vanquish超高效液相色谱仪3种高效液相色谱系统以及Waters XBridge C18和Thermo Hypersil GOLD对5种化合物RCF的影响。结果表明,在各种条件下汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的RCF分别为0.771、0.519、0.577、1.080、0.837,RSD值均≤1.54%,表明各化合物的RCF在不同高效液相色谱仪与不同色谱柱间重复性良好。结果见表6。

表6 不同高效液相仪器和不同色谱柱下各成分相对于黄芩苷的RCF (n=6)

2.13 样品的测定及验证

取6批大柴胡颗粒,按照2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.4项下色谱条件进样,用外标法(ESM)和QAMS法测定6种化合物的含量,结果见表7。结果显示,2种测量方法所得结果的RSD值均≤1.48%,表明QAMS 法可作为大柴胡颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的质量控制方法。该方法准确、可靠。

表7 一测多评法与外标法测定大柴胡颗粒中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的含量结果

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

大柴胡颗粒中柴胡和黄芩为君药,为了整体、全面地评价和控制其质量,以君药(柴胡和黄芩)的有效成分作为指标成分对其质量进行控制。2020年版《中国药典》对柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量进行控制[8]。但大柴胡颗粒制备过程中柴胡为水煎提取,柴胡皂苷的原型成分易转化为次生皂苷,且在酸性洗脱系统下易发生结构转化,因此选择柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2作为柴胡质量控制的指标。黄芩味苦、性寒,有清热燥湿、泻火解毒的功效,药效学研究表明主要是黄酮类化合物(包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素)发挥药理作用,因此选择以上4种黄酮类化合物对黄芩进行质量控制。

3.2 内参的选择

QAMS仅需1个价廉、易得的有效成分, 即可实现多成分的同步测定[9]。药效学研究表明,黄芩中的主要药效成分为黄酮类化合物,黄芩苷的含量高、性质稳定、价格低廉,同时黄芩苷已成为黄芩饮片、小柴胡颗粒和大柴胡颗粒等质量控制的检测指标,现代药理研究表明,黄芩苷具有显著的生物活性[10]。因此,本研究选择黄芩苷作为QAMS的内标物。

3.3 流动相和检测波长的选择

本研究筛选了多种流动相(包括甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸、乙腈-1 mL·L-1冰醋酸等),其中甲醇-1 mL·L-1磷酸基线比较平稳,黄芩苷在酸性条件下较纯水的峰形更尖锐,灵敏度更高。另外,考虑到色谱柱对酸的耐受性,最终选择甲醇-1 mL·L-1磷酸作为流动相。在200～350 nm波长范围内对6种成分进行扫描,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、柴胡皂苷B1和柴胡皂苷B2的最大吸收波长分别为278、274、276、276、254、252 nm。在252、254、276、276 nm处对大柴胡颗粒供试品溶液的紫外吸收情况进行分析,最终选择各化合物响应最好的254 nm作为检测波长。