通用多重不对称PCR联合基因芯片实现下呼吸道病原菌及耐药基因快速检测*

刘俊杰,谢海宇,张艳妮,陈桂柳,何小维,王 羽

1.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510641;2.广州万孚生物技术股份有限公司,广东广州 510670;3.生物岛实验室/广州再生医学与健康广东省实验室,广东广州 510005

下呼吸道感染(LRTI)已经成为全球面临的重大公共卫生问题。2016年全球约有3.36亿例LRTI患者,导致约238万人死亡,是全球第六大致死原因[1]。由不同病原菌引起的LRTI临床表现非常相似,单凭临床症状和病理特征难以鉴别,在病原菌没有得到正确识别的情况下,可能会导致抗菌药物滥用[2]。同时,耐碳青霉烯酶的革兰阴性杆菌在全球范围内广泛传播,碳青霉烯类抗菌药物的不合理使用是导致革兰阴性杆菌耐药率上升的重要原因[3]。因此,快速鉴定识别呼吸道感染病原菌及其携带的耐药基因对临床准确诊断和合理用药具有重要意义。用于识别呼吸道病原菌的传统方法包括病原菌分离培养法、涂片镜检法、ELISA和免疫荧光法等[4],这些传统方法均存在检测周期长、操作复杂、灵敏度低等不容忽视的问题。近年来,分子检测技术的快速发展在很大程度上弥补了传统培养和免疫分析方法用于呼吸道病原菌检测的不足,大大提高了呼吸道病原菌检测的速度、灵敏度和特异度[5]。然而,受荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测通道的限制,一次检测不超过5种靶标[6-7],基因芯片结合通用多重不对称PCR能够有效解决这一问题。基因芯片技术是依据核酸序列碱基互补配对的原则,将被标记的PCR产物与固定在芯片表面的探针进行分子杂交,然后通过采集杂交信号对标本进行分析,是一种特异性强、灵敏度高的基因分析方法。通用多重不对称PCR是在特异性引物的5′端连接一段异源通用序列,通过特异性引物介导的第1阶段扩增和通用引物介导的第2阶段扩增实现对多种靶序列的同步、高灵敏、高特异性扩增,从而较好地解决多重PCR中引物相互干扰、扩增效率差等缺点,提高PCR的反应重数。因此,基因芯片检测技术与通用多重不对称PCR技术联合使用可实现二者优势互补,通用多重不对称PCR的扩增作用和基因芯片的多位点杂交技术可以很好地提高检测通量[8]。本研究建立的基于通用多重不对称PCR联合基因芯片技术的LRTI病原菌及耐药基因检测方法(下称本方法)可同步检测大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌6种常见的下呼吸道病原菌和两种碳青霉烯酶基因(blaKPC和blaVIM),可在4 h内完成检测并输出结果,可有效助力临床LRTI的快速诊断及干预。

1 材料与方法

1.1标准菌株 选取目标菌株和非目标菌株的标准菌株共14株,用于方法的建立及特异度和灵敏度的评估。肺炎克雷伯菌(ATCC BAA-1902)、大肠埃希菌(ATCC BAA-2452)、金黄色葡萄球菌(ATCC 43300)、肺炎链球菌(ATCC 49619)、鲍曼不动杆菌(GDMCC 1.1336)、卡他莫拉菌(ATCC 25238)、弗氏柠檬酸杆菌(GDMCC 1.1337)、阴沟肠杆菌(GDMCC 1.1338)、产酸克雷伯菌(GDMCC 1.1340)、黏质沙雷菌(ATCC 8100)、奇异变形杆菌(ATCC 35659)、表皮葡萄球菌(ATCC 700566)、唾液链球菌(ATCC 13419)、流感嗜血杆菌(ATCC 49766)均购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.2仪器与试剂 赛默飞ABI7500实时荧光定量PCR(qPCR)仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)、晶芯LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪(北京博奥晶典生物技术有限公司)、晶芯BioMixerTMⅡ芯片杂交仪(北京博奥晶典生物技术有限公司)、sciFLEXARRAYER S12非接触式超微量喷点系统(德国Scienion公司)、2×Lyo-Ready qPCR Mix(美国Meridian公司)、核酸提取及纯化试剂(广州达安基因股份有限公司)、环氧硅烷修饰芯片片基(德国Schott公司)、洗液1[1×柠檬酸钠盐缓冲液(SSC)+0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)]、洗液2(0.1×SSC+0.1%SDS)、杂交缓冲液(美国Boston BioProducts公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 标准菌株、肺泡灌洗液和痰液均按照达安基因核酸提取及纯化试剂说明书进行标本核酸提取。

1.3.2引物探针设计与合成 参考文献[9-14]设计与合成检测肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、卡他莫拉菌的特异性引物。根据GenBank中已公布的mt-DNA、blaKPC、blaVIM基因序列,使用Primer premier 5.0软件分别设计特异性引物,用于第1步PCR扩增。在每对特异性引物的5′端设计一段非同源通用片段。使用Primer premier 5.0软件根据不对称PCR产物分别设计捕获探针和荧光探针,荧光探针5′端使用HEX标记,捕获探针5′端氨基化修饰并加poly(T4)。引物探针序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。设计的引物目标片段的序列长度为100～300 bp,针对各靶基因设计的探针长度为23 bp左右。

1.3.3芯片制备 使用点样缓冲液稀释探针至40 μmol/L的终浓度,混匀加入384孔板中。在室温和50%相对湿度的条件下利用芯片点样仪将探针按预设程序在环氧基玻片上进行喷点式点样,点阵排列见图1。每个位点的点样量为670 pL,点样直径为100 μm,点样间距为300 μm。将点样完毕的芯片置于敞口盒中,在22 ℃、70%相对湿度水化过夜。在封闭液中浸泡5 min,超纯水清洗;使用0.1%的SDS溶液以50 r/min摇床清洗5 min,再次用超纯水清洗后以1 000 r/min离心干燥,置于室温避光保存备用。

注:①为质控DNA;②为碳青霉烯酶基因blaKPC;③为碳青霉烯酶基因blaVIM;④为鲍曼不动杆菌;⑤为金黄色葡萄球菌;⑥为肺炎链球菌;⑦为大肠埃希菌;⑧为卡他莫拉菌;⑨为肺炎克雷伯菌;为定位探针;为阴性对照。

1.3.4PCR扩增 以DNA为模板,使用特异性引物进行PCR扩增。第1步PCR体系:2×Lyo-Ready qPCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上、下游特异性引物各0.5 μL,模板5 μL,补充ddH2O至50 μL。反应程序:94 ℃ 120 s;94 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,10个循环;94 ℃ 5 s,65 ℃ 30 s,12个循环,产物4 ℃保存。第2步PCR体系:2×Lyo-Ready qPCR Mix 25 μL,10 μmol/L的上游通用引物5 μL,10 μmol/L的下游通用引物0.25 μL,模板5 μL(第1步PCR扩增产物),补充ddH2O至50 μL。反应程序:94 ℃ 120 s;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,30个循环,产物4 ℃保存。

1.3.5通用不对称引物浓度比的优化 通用引物的上、下游引物浓度比是影响通用不对称PCR产物杂交效率的关键因素。选择8种靶标的混合菌液作为标本进行优化,首先固定下游通用引物浓度为50 nmol/L,然后设置不同浓度比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1和50∶1)的上、下游引物进行多重不对称PCR和芯片杂交分析。

1.3.6芯片杂交与信号分析 取30 μL扩增产物、80 μL杂交缓冲液、10 μmol/L的荧光探针各1.6 μL,补充ddH2O至160 μL混合均匀转移至芯片杂交仪中以55 ℃、10 r/min连续避光杂交70 min。杂交完成后取出芯片,将杂交反应完毕的基因芯片置于玻片架上,分别在洗液1、2中清洗2次,每次1 min,离心甩干。使用晶芯LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪采集荧光信号,设定条件:Cy3绿色荧光通道,Power:50%,PMT:600,分辨率:5 μm。分析每个样点荧光信号的中值,当某一位点的信号值大于阴性质控探针信号值加3倍标准偏差即判定该位点为阳性,每个靶基因设置的4个重复位点出现≥3个位点为阳性,即可判定该靶标为阳性。按照上述操作,将8种靶标的标本核酸等量混匀作为PCR模板,进行杂交温度(45、50、55、60 ℃)和杂交时间(30、50、70、90 min)的优化,选择最佳杂交温度和杂交时间。

1.3.7灵敏度试验 将各目标基因的标准模板调整至104copy/mL进行10倍梯度稀释作为模板,按照最优的反应条件进行扩增和杂交,以验证本方法的灵敏度。

1.3.8标本检测 选取实验室检测无致病菌污染的肺泡灌洗液为基质,分别与不同目标菌液混合,制备人工模拟标本,利用本方法进行检测,验证本方法对多重感染检测的准确性。同时,收集24份临床痰液标本使用本方法及分离培养后的VITEK 2 生化鉴定法、单重qPCR进行检测并鉴定,通过比较3种方法的最终检测结果,评估临床应用效果。

2 结 果

2.1不同通用引物浓度比对应的荧光信号值 通用引物的浓度比是影响通用不对称PCR效率的关键因素。利用通用引物不同浓度比的上、下游引物分别进行多重不对称PCR和芯片杂交分析见表1。当上、下游引物浓度比为20∶1时,杂交信号最强。因此,确定通用多重不对称PCR上游通用引物的最佳浓度为1 000 nmol/L,下游通用引物的最佳浓度为50 nmol/L。

表1 不同通用引物浓度比对应的荧光信号值(A.U.)

2.2不同芯片杂交温度对应的荧光信号值 为选择最佳的标本杂交温度,将芯片置于45、50、55、60 ℃条件下杂交30 min后进行荧光信号检测见表2。在相同时间内,55 ℃时杂交信号最强。

表2 不同芯片杂交温度对应的荧光信号值(A.U.)

2.3不同芯片杂交时间对应的荧光信号值 为选择最佳的标本杂交时间,将杂交温度设置为55 ℃,分析杂交30、50、70、90 min的芯片荧光信号强度见表3。荧光信号的整体强度随杂交时间的延长而增强。在相同温度下,杂交反应时间为70 min时荧光信号最强。

表3 不同芯片杂交时间对应的荧光信号值(A.U.)

2.4灵敏度 将各目标菌株的标准菌液进行梯度稀释,按照最优的反应条件进行扩增和杂交见图2。高浓度菌液的芯片扫描图均有清晰可见的荧光位点,随着菌液浓度降低,荧光强度也明显减弱。最终,本方法检测大肠埃希菌的灵敏度为104copy/mL,碳青霉烯酶基因blaKPC、碳青霉烯酶基因blaVIM、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的灵敏度均为103copy/mL,金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和卡他莫拉菌的灵敏度均为102copy/mL。

注:A为碳青霉烯酶基因blaKPC;B为碳青霉烯酶基因blaVIM;C为鲍曼不动杆菌;D为金黄色葡萄球菌;E为肺炎链球菌;F为大肠埃希菌;G为卡他莫拉菌;H为碳青霉烯酶基因blaKPC+肺炎克雷伯菌;数字1、2、3分别表示浓度为104、103、102 copy/mL。

2.5特异度 标准菌株加入临床检测无菌的肺泡灌洗液作为模拟标本,无菌肺泡灌洗液作为阴性标本,在最佳反应条件下分别对其进行检测,评价本方法的特异度。图3A～3H目标菌株各靶基因对应的探针位点出现的杂交信号清晰可见,均符合阳性的预期结果。而其他位点均未出现荧光信号,并且以产酸克雷伯菌、黏质沙雷菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、唾液链球菌、流感嗜血杆菌为干扰菌的模拟标本的检测结果与阴性标本检测结果一致,靶标位置均无荧光信号检出,见图3I。

注:A为碳青霉烯酶基因blaKPC;B为碳青霉烯酶基因blaVIM;C为鲍曼不动杆菌;D为金黄色葡萄球菌;E为肺炎链球菌;F为大肠埃希菌;G为卡他莫拉菌;H为碳青霉烯酶基因blaKPC+肺炎克雷伯菌;I为阴性标本及干扰菌。

2.6模拟标本检测结果 将不同菌株组合混匀,模拟多重细菌感染,对模拟标本进行检测见图4。模拟标本检测符合率均可达100%,能特异性检出对应的靶标,说明本方法具有较好的检测分辨力。

注:A为碳青霉烯酶基因blaVIM+肺炎链球菌+卡他莫拉菌;B为鲍曼不动杆菌+金黄色葡萄球菌+卡他莫拉菌;C为碳青霉烯酶基因blaKPC+鲍曼不动杆菌+金黄色葡萄球菌+卡他莫拉菌+肺炎克雷伯菌;D为鲍曼不动杆菌+肺炎链球菌。

2.7临床痰液标本检测结果 利用本方法对24份临床痰液标本进行核酸提取、扩增及芯片杂交,分析杂交信号见表4。本方法检出单一病原菌感染17份,多病原菌感染7份,携带耐药基因5份,该检测结果与单重qPCR鉴定结果一致。由于VITEK 2生化鉴定法不能进行碳青霉烯类耐药基因鉴定,且VITEK 2生化鉴定法需对标本进行分离培养,对于混合感染标本的检测易受优势菌株干扰而导致漏检,故VITEK 2生化鉴定法鉴定出单一病原菌感染22份,多病原菌感染2份,与真实结果存在一定误差。

表4 临床痰液标本的检测结果(n)

3 讨 论

多重PCR可以快速、灵敏地同步扩增多个目标片段,已被越来越多地用于病原菌检测技术研究领域。基因芯片也是一种高通量、快速、准确的分子生物学检测技术。本方法可以在同一个反应中同时检测6种下呼吸道常见病原菌和两种碳青霉烯酶基因。

在致病菌检测领域,多重PCR和基因芯片的联合应用已有相关报道,有研究建立了一种基于将多重连接酶检测反应及通用不对称PCR与通用基因芯片方法联合的检测方法,纯培养物的检测灵敏度为102～103copy/mL[15],与本方法的灵敏度相当。SONG等[16]针对8种碳青霉烯酶基因建立了基于多重PCR和基因芯片的检测方法,其检测灵敏度最低为30 copy/μL。基于多重PCR的基因芯片技术使在一个试管中同时检测多个目的基因成为可能,但通过电泳法根据产物序列大小分离并不能有效鉴定各种片段[17]。相比之下,本方法耗时更短,并且可以在单次反应中设计更多的待检靶标。

本研究通过多重PCR扩增富集目的基因,并利用通用不对称PCR扩增大量单链目标片段用于DNA杂交,二者结合能够实现多重PCR和基因芯片的优势互补,达到较高的灵敏度和特异度。此外,针对每个靶基因设计了特异的荧光探针,在杂交反应中特异性结合在目标片段的5′端。只有当标本中靶基因经两轮PCR后的扩增产物与固定在芯片表面的捕获探针和杂交液中的荧光探针同时发生杂交反应时,才能在芯片表面的预设位点检测到荧光信号,这一双重特异性设计保证了本方法的准确性。

此外,目标片段的长度是影响杂交效率的重要因素。有研究表明,短片段较长片段目标序列能产生更高的杂交信号[18]。因此,本研究设计的引物目标片段的序列长度为100～300 bp。探针的设计是建立基因芯片检测方法的关键,本研究针对各靶基因设计的探针长度为23 bp左右,且具有相近的DNA熔解温度,使各靶基因的杂交反应接近最佳反应条件,经过NCBI BLAST验证,均具有较强的特异性。此外,有研究表明,DNA杂交效率与目标序列上捕获探针的位置具有关联,具体表现为目标序列的5′伸出端的长度与杂交信号强度呈负相关[19]。因此,本研究设计的捕获探针与目标序列的结合区域均靠近5′端,以提高信号强度。

考虑到下呼吸道病原菌种类繁多且细菌耐药方式并不局限于产碳青霉烯酶,本研究建立的DNA微阵列不能涵盖所有的病原菌基因。因此,一些致病菌和耐药基因不在芯片的检测范围内。在后期研究中,可以根据临床需求灵活改变或增加反应体系中的引物和探针序列,将本方法用于其他靶标的检测。

使用本方法对下呼吸道病原菌进行检测,在预先制备好基因芯片的情况下,经过核酸提取、PCR扩增、基因芯片分子杂交、芯片扫描等步骤,总检测时间约为4 h,且具有高灵敏度、高特异度、高准确度的特点,相对于传统的病原菌检测方法更高效、准确。本方法也可搭载于广州万孚BoxArray全自动多重核酸检测分析系统上,将核酸提取、扩增、杂交和检测的所有过程集成于卡盒内部,实现标本进结果出的全自动检测过程,为临床诊断提供快速指导,避免药物滥用[20]。