淫羊藿药材中黄酮类成分提取工艺优选*

张秀秀，杨 洁，何 洁，王仕宝△，何志鹏，房 宇，张 慧，向 仪

（1. 汉中职业技术学院药学院，陕西 汉中 723000； 2. 汉中职业技术学院秦巴山区药〈食〉用植物研究所，陕西 汉中 723000； 3. 陕西省汉中市食品药品监督检验检测中心，陕西 汉中 723000； 4. 陕西国际商贸学院医药学院，陕西 西安 712046）

淫羊藿为小檗科淫羊藿Epimedium brevicomuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Max⁃im.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim. 或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumNakai 的干燥叶［1］，具有补肾壮阳、益精补气等功效，主治腰膝酸软、风湿痹痛、四肢麻木不仁等病症［2］。有研究表明，其在抗衰老、提高免疫力、抑制肿瘤细胞生长、控制心血管系统疾病中疗效显著［3-4］。淫羊藿总黄酮（TFE）为淫羊藿药材最主要的化学成分，现代药理学研究表明，TFE对内分泌组织、免疫系统、骨与肿瘤及心脑血管系统均有益［5-7］。基于此，本研究中通过响应面法，以朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ等6 种黄酮类成分总含量为评价指标，优选淫羊藿药材最佳提取工艺。现报道如下。

(4) 2台FEP采用自开发软件接口协议与外部时钟源同步，但无法确保2台FEP的时钟精度偏差均在50 ms内(仅采用NTP或PTP协议时才能确保精度在50 ms内)，不能同时为下一层提供时钟源服务。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260B 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；DS-8510DTH型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XSR205DU 型精密电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

朝藿定A1对照品（批号为P02J9S64790）、朝藿定A对照品（批号为P02J9F64787）、朝藿定B对照品（批号为G19A11L121806）、朝藿定C对照品（批号为N18GB166250）、淫羊藿苷对照品（批号为T11A11B111118）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号为A20GB158231），均购于上海源叶生物科技有限公司（含量≥98%）；乙腈、甲醇、乙醇均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。淫羊藿药材样品于2020年5月1日采集于陕西省汉中市宁强县，经汉中职业技术学院秦巴山区药（食）用植物研究所王仕宝副教授鉴定为箭叶淫羊藿的干燥叶；选取绿色鲜艳、完整叶片阴干后保存；试验前将药材样品粉碎（过3 号筛），密封，备用。

在政策和资金扶持上，各县（市）均出台了招商引资优惠政策。其中，麻江县规定对在规划区内规模连片种植3.33 hm2以上规定品种经济林的，政府均免费提供苗木或按1.35万～1.5万元/hm2的标准给予苗木费补助；对种植业主申请银行贷款用于发展经济林、中药材等水土保持林草建设的，在规定年限和贷款额度内政府给予贴息。雷山县规定利用荒山或坡耕地种植茶叶并验收合格的，一次性补助0.6万元/hm2，对每个加工厂一次性补助5万元。岑巩县政府则直接出资180万元，扶持投资者建成油茶、核桃基地667多hm2。黄平县在肥料、财税、土地、规费等方面对民间投资者给予相应扶持。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

系统适用性试验：取上述混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，理论板数按淫羊藿苷峰计应大于8 000；分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图1。

色谱柱：AgilentEclipsePlus-C18柱（250mm×4.6mm，5µm）；流动相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～35 min时74%A，35～36 min 时74%A →55%A，36～45 min 时55%A →53%A，45～60 min 时53%A →47%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

取朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品各适量，精密称定，用甲醇溶解，制得质量浓度分别为675，698，684，679，657，636 µg/mL的单一对照品溶液；分别精密量取适量，混合，即得混合对照品溶液。取药材样品粉末约0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密量取50%乙醇10 mL 置锥形瓶中，称定质量，超声（功率600 W、频率40 kHz，下同）提取60 min，冷却，再次称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，经0.22µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.2 溶液制备

2.1.3 方法学考察

在1917年法国皮卡第的一场战斗中，德军突破了防线，直接冲入了英法联军的阵地，正在挖战壕的华工们猝不及防，他们只得用铁锹、镐头与德国兵肉搏，当英法联军赶到时，大部分华工已战死。

考虑到新增匝道的驶入、驶出点必须在现有道路的某一侧，因此以上图中新增匝道②-①为实例工程进行分析，可知其可行的驶入、驶出点均为3处，因此可行的新增匝道方案如图3所示。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.1.2项下混合对照品溶液适量，制成系列混合对照品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系与检测限、定量限考察结果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantification

提取时间：固定液料比为100，以50%乙醇分别超声提取20，30，40，50，60 min，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，提取40 min 时待测成分提取总量最高，随后开始逐渐下降，故选择提取时间为40 min。详见图3 b。

液料比：在液料比分别为50，100，150，200，250 的条件下，以50%乙醇超声提取60 min，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，液料比为50，100时待测成分提取总量较高。因液料比为50时，提取溶液过于浓稠，不方便过滤，且各成分峰面积、峰高相差较大，故选择料液比为100。详见图3 a。

稳定性试验：取2.1.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积的RSD分别为2.50%，1.57%，1.92%，0.46%，1.62%，1.43%，（n= 6），表明供试品溶液在室温条件下放置24 h 内基本稳定。

重复性试验：取样品适量，精密称定，各6 份，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积的RSD分别为1.15%，1.83%，0.74%，1.47%，2.89%，0.92%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品适量，共9 份，分别加入80%，100%，120%质量浓度的混合对照品溶液，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的平均加样回收率分别为99.96%，100.34%，99.98%，100.48%，100.22%，101.11%，RSD分别为0.19%，0.41%，1.93%，1.95%，0.80%，2.39%（n=9）。

2.2 单因素试验

模型拟合：采用Design Expert 11 软件进行多元回归拟合，得待测成分提取总量（Y）与各因素变量的关系方程：Y= 3.118 + 0.115A- 0.034 2B+ 0.024 2C+0.055 0D- 0.192 5AB- 0.072 5AC- 0.005AD-0.01BC-0.055BD+0.06CD-0.2398A2-0.04858B2-0.098 58C2-0.187 3D2。

图2 试剂体积分数对提取总量的影响Fig.2 Effect of volume fraction of solvent on the total extraction amount

精密度试验：取2.1.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果朝藿定A1、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ峰面积的RSD分别为0.38%，0.30%，0.32%，0.35%，0.56%，0.84%（n=6），表明仪器精密度良好。

图3 不同因素对提取总量的影响Fig.3 Effect of different factors on the total extraction amount

检测限与定量限考察：分别精密量取2.1.2项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以信噪比为3︰1、10︰1 时各成分的质量浓度分别计为检测限、定量限。结果见表1。

提取次数：固定液料比为100，以50%乙醇超声提取1～4 次，每次40 min，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，当提取次数超过2 次时，总黄酮的提取率缓慢下降，故选择提取次数为2 次。详见图3 c。

2.3 响应面法设计

试验设计：根据上述单因素试验结果，以乙醇体积分数（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素C）、液料比（因素D）为考察因素，待测成分提取总量为考察指标，采用响应面软件Design Expert 11.0 优选提取工艺［8-12］。因素与水平见表2，响应面试验设计及结果见表3。

1）绘图计算。主要用于图形界面的绘图操作，如绘制深度信息的时间曲线。绘图操作通过Qt的绘图类QPainter等实现。

表2 因素与水平Tab.2 Factors and their levels

表3 响应面试验设计及结果Tab.3 Design and results of the response surface test

提取溶剂：固定液料比为100（mL/ g，下同），以不同溶剂超声提取60 min，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果表明，50%乙醇、50%甲醇作为提取溶剂时待测成分提取总量均较高，因甲醇毒性、挥发性较强，乙醇较安全、经济、环保，故选择50%乙醇作为提取溶剂。详见图2。

方差分析：模型回归参数方差分析结果见表4。该模型较显著（F= 4.60，P< 0.003 6），表明响应回归模型差异有统计学意义；模型中失拟项不显著（F=1.91，P =0.279 0 > 0.05），表明该模型设计合理。方程中A，AB，A²，D²对待测成分提取总量的影响有统计学意义，故可用此模型对提取工艺进行分析和预测。结果表明，因素A 具有显著意义，为主要因素；因素D 影响强度大于因素B、因素C，因素D 是影响提取总量的次要因素。

统计1970—1998年和1999—2016年Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区相对湿度、日平均温度、日照时间和日平均风速年序列，由图4可知，相对湿度随海拔增加而减小，海拔低于1500 m的区域相对湿度约为80%，而在1500 m以上区域，相对湿度降至60%~65%；日平均温度随海拔升高而降低；日照时间和风速则随海拔增加而增加，且日照时间随海拔变化的变化幅度和相对湿度变化较为一致。

实验结论分析 在学期末对实验组和对照组进行一对一听说测试，测试标准参照文献[5]中的“加德纳的社会—教育模式”（见图2），对幼儿进行正规语境和非正规语境两个方面的测试。本研究中正规语境的测试题目由学前教育专家指导，乡镇统一制定。测试结束后，用SPSS软件对实验组和对照组的测试成绩进行显著性差异检验。非正规语境的测试主要由监考教师反馈整理。

表4 回归模型的方差分析结果Tab.4 Results of the ANOVA of regression model

响应面预测与验证：采用Design - Expert 11.0 软件分析试验结果，得到提取总量与各因素交互作用的三维响应面图和等高线图。因素AD 间、CD 间交互作用较强，结果影响显著。淫羊藿药材最佳提取工艺为液料比为100 时，以50%乙醇提取2 次，每次40 min。详见图4。

图4 不同影响因素间响应面图及等高线图Fig.4 Response surface diagrams and contour diagrams of different influencing factors

验证试验：验证最佳工艺，平行3次，结果药材样品中待测成分提取总量分别为3.16%，3.08%，3.03%，与预测值（3.12%）相当。

3 讨论

由于产地、采收季节、生长方式、干燥方式、淫羊藿药材种类、提取检测方法不同，淫羊藿药材中黄酮类成分的种类和含量也存在一定差异。预试验中考察提取工艺时，比较了醇提法、水提法、超声醇提法［13-17］，发现超声醇提法对黄酮类成分的提取量相对较高，故选择该法。按响应面法软件构建的最佳提取工艺进行验证，淫羊藿叶中6种成分提取总量的实际测定值与预测值基本一致。预试验中还分别以水-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈［18］、0.1%甲酸水溶液-乙腈［19］作为流动相进行梯度洗脱，发现以0.1%磷酸水溶液-乙腈和水-乙腈作为流动相时，色谱峰峰形良好，分离度大，拖尾不明显，但由于以磷酸盐作为流动相，在质量浓度较低时易结晶析出，易造成色谱柱堵塞，冲洗色谱柱耗时较长，故选择水-乙腈作为流动相。在流动相梯度变化时间范围内，适当缩小水相的质量浓度，即可将待测6 种黄酮类成分完全分开，且出峰时间也会随之缩短，前期试验中的标准品溶液是用纯甲醇配制的，6 种成分的峰形均为前沿峰，后续在配制标准品溶液时，加入了少量的水，使其成为含水12%～15%的甲醇溶液，进样分析后发现峰形前沿情况明显改善，峰形和分离度较好。

2020 年版《中国药典（一部）》［1］明确淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的总量不得少于1.5%，其中朝鲜淫羊藿不得少于0.5%。朝藿定A1因性质和朝藿定A接近，故在相同色谱条件下也能被分离出。宝霍苷Ⅰ是淫羊藿苷在体内的水解产物［2］，具有显著的抗氧化、抗骨质疏松［3］、抗肿瘤活性，2020 年版《中国药典（一部）》将其列为炙淫羊藿药材含量测定的指标成分之一［1］，由于淫羊藿总黄酮在淫羊藿的化学成分中的含量最高［3］，药理作用强，临床应用广，故将2 种黄酮类成分纳入本次考察。

综上所述，本研究中优选的提取工艺合理可行，可为淫羊藿药材的进一步研发提供参考。