菌肥对设施芹菜产量及土壤细菌群落结构的影响

章祖荣，章斯斯，徐蒋来

（1.浙江国旵生态科技有限公司，浙江台州 318020；2.台州市农业科学研究院，浙江台州 317000）

2021 年，浙江省台州市蔬菜种植面积在6.60 万hm2左右。调查发现，种植多年蔬菜土壤出现板结、酸化、养分失衡、团粒结构破坏等问题时有发生，土壤微生物群落结构遭到严重破坏。而土壤细菌是土壤微生物中最活跃的因子，占土壤微生物总数的70%～90%。因此，研究土壤细菌群落结构具有重要的意义。

化肥对增加土壤肥力和提高作物产量起着重要的作用，但同时也带来一系列问题，如农业生态系统破坏、环境污染严重、作物品质和土壤质量下降等[1-2]。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，驱使土壤有机物分解，参与物质循环过程，是最重要的土壤肥力活性因子，其物种多样性是生态系统稳定的关键。一般而言，稳定性较好的土壤，微生物抵抗环境恶化的能力较强。微生物菌肥作为绿色环保的新型肥料，含有大量有机质和有益微生物，如枯草芽孢杆菌等。其中，有益微生物在其生命活动过程中，产生大量次生代谢产物有机酸，不断释放土壤中的迟效态氮磷钾[3]。研究发现，施用微生物肥料增加了土壤速效养分和有机质等含量，提高土壤脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶等活性[4]。因此，微生物菌肥通过改善土壤质地、增加土壤养分有效性和调节土壤微生物区系结构组成来提高土壤生物活性，使土壤向健康方向发展[5]。

高通量测序以测序数据量大、可信度高优势成为研究微生物群落多样性的主要方法之一。目前主要研究集中在林木、粮食作物为研究对象或不同菌肥类型处理对其的响应，而不同菌肥量代替化肥对设施芹菜土壤细菌群落结构的影响鲜有报道[6-11]。因此，本研究以设施芹菜土壤为研究对象，设置三个不同菌肥量替代化肥的梯度，通过高通量测序技术，分析其对土壤细菌群落结构多样性的影响，探明改良设施芹菜土壤的最佳微生物菌肥量，为揭示微生物菌肥肥效提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地选择在浙江省台州市黄岩区南城街道药山村蔬菜大棚（28°60′N，121°28′E）。该地属亚热带季风湿润气候，温暖湿润，四季分明，年平均气温16.9 ℃，10 ℃以上的平均年积温5 316 ℃，无霜期253 d，年均降水量1 391 mm，年均蒸发量1 231.4 mm。试验地土壤性质为粘土，基础土样pH 值为5.30，有机质44.4 g·kg-1，有效磷669.5 mg·kg-1，速效钾125 mg·kg-1，水解性氮185.6 mg·kg-1。

1.2 试验材料

微生物菌肥采用北京中耕绿洲生态科技有限公司的中耕沃土生物有机肥，其中含有效活菌数5.0亿·g-1，有机质40%，富含枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。化肥为复合肥，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=15∶15∶15。

1.3 试验设计

试验共设计9 个小区，每小区面积333.3 m2。试验地前茬作物为小白菜，在2021 年10 月25 日开始试验布置，共设置3 个处理：1 500 kg·hm-2化肥（CK）、微生物菌肥1 500 kg·hm-2+750 kg·hm-2化肥（T1）、微生物菌肥3 000 kg·hm-2+750 kg·hm-2化肥（T2），每个处理均配施鸡粪有机肥4 500 kg·hm-2，每处理3 次重复。于2021年10月30日种植芹菜，日常管理同常规。2022 年1 月5 日采收、测产，并于当日采用五点取样法采集土样，剔除枯叶等杂质后装入无菌聚乙烯封口袋中，混合均匀，-80 ℃低温保存，用于高通量测序。

1.4 测定方法

1.4.1 土壤细菌群落结构测定

土壤基因组DNA 的提取：首先对样本采用CTAB方法提取总的DNA，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度，取适量的样本DNA 于离心管中，使用无菌水稀释样本至1 ng·μL-1。

目标片段PCR扩增：以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode 的特异引物，Buffer 和高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。

PCR 产物的混样和纯化：PCR 产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR 产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用1×TAE 浓度2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR 产物，剪切回收目标条带。产物纯化试剂盒使用的是Thermo Scientific 公司的胶回收试剂盒回收产物。

文库构建和上机测序：使用Thermofisher 公司的建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，进行NovaSeq 上机测序（北京果壳生物科技有限公司）。

1.4.2 芹菜品质测定

每个小区采集芹菜茎1 kg 用于测定粗纤维和维生素C 含量。其中粗纤维含量的测定方法参照《GB/T 5009.10-2003》；维生素C 含量的测定方法参照《GB 5009.86-2016》。

1.4.3 芹菜产量测定

每个小区选取3 m2面积，采用人工拔取，去除根部，用精度为0.01 g 的电子秤测产，最后换算成每公顷产量。

1.5 数据分析

测序后对原始数据进行拼接、过滤、去除嵌合体处理，得到优化序列，进行Alpha 多样性分析、物种组成分析及物种差异分析。试验数据均采用Microsoft Excel 2010 进行统计分析，SPSS 19.0 进行方差和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对土壤测序结果和α 多样性指数的影响

稀疏曲线用于验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，并间接反映样品中物种的丰富程度。图1 反映了持续抽样下新物种出现的速率：在0～60 000 条范围内，随着测序条数的加大，曲线趋于平缓，表示此环境中的物种并不会随测序数量的增加而显著增多，说明此次测序可以反映不同肥料处理对土壤细菌群落结构多样性的真实情况。

图1 不同肥料处理下土壤细菌群落的稀疏曲线

由表1 可知，对不同肥料处理土壤进行Nova Seq高通量测序，所测数据经过去除嵌合体序列处理后，每个样品有效序列总数在57 468～62 744 个。在97%相似度水平下，每个样品细菌OTU总数在894～1 371，覆盖度均在99.9%以上，说明即使开展更深的测序也不会产生更多的OTUs数，即测序文库已达到饱和状态。

表1 不同施肥处理对土壤测序结果和α多样性指数的影响

Chao1 指数表示物种丰富度，Shannon 和Simpson指数表示物种多样性。由表1可知，在物种丰度方面，T1和T2处理使Chao1 指数有不同程度的降低，平均值分别较对照降低了33%和14.6%。相对于Shannon 指数，T1和T2处理同样使Shannon 指数有不同程度的降低，平均值分别较对照降低了13.5%和4.8%，表明T1和T2处理导致土壤中细菌多样性降低，且T1处理效果更明显。相对于Simpson 指数，T1处理最小为0.99，CK和T2处理均为1.00。总体而言，T1和T2处理对土壤细菌丰富度和多样性具有一定程度的抑制作用，且T1处理更明显。

Venn图可用于统计多组或多个样本中所共有和独有的物种数目，比较直观地表现环境样本的物种组成相似性及重叠情况。从图2 可知，经不同施肥处理的土壤共有细菌OTU 数为286 个，分别占CK、T1、T2处理组总OTU 数的17.00%、23.93%、19.18%。CK、T1、T2处理特有的细菌OTU 数分别为936、351、715 个，分别占各处理总OTU 数的55.71%、29.37%、47.95%。说明T1处理对细菌的影响大于T2处理，T2处理土壤中的细菌组成与CK处理更接近。

图2 不同处理下土壤细菌OTU分布Venn图

2.2 不同施肥处理对土壤细菌群落结构的影响

利用PCA 分析土壤细菌群落结构相似性与差异性，通过主成分分析可以实现多个样品的分类，进一步展示不同样品间物种多样性差异，坐标图上距离越近的样品，样品的组成越相似。由图3 看出，PC1 是造成样品差异性的最大主坐标成分，其次是PC2，分别解释了28.31% 和25.04% 的贡献率，两个主坐标轴总贡献率达53.35%。T2处于第一象限，CK 处于第二象限，T1处于第四象限，说明不同菌肥处理改变了细菌群落结构。在PC1维度上，将CK 处理和其余2个处理分开，说明CK 处理与T1、T2处理间细菌群落结构存在差异性。

图3 不同处理下土壤细菌群落结构PCA图

土壤样品中共检测出细菌23 门70 纲141 目206 科308属139种。由图4可知，在门水平下，排在前10的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞(Gemmatimonadetes)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospira)、棒状杆菌门(Rokubacteria)。变形菌门(Proteobacteria)作为三个处理的优势菌门，相对丰度均占据50%左右。相比对照CK，T1、T2处理下滋生土壤厚壁菌门(Firmicutes)，这与菌肥中所含菌种为芽孢杆菌属有关，系厚壁菌门类，且T1处理占比大于T2处理。相比CK，T1和T2处理降低了酸杆菌(Acidobacteria)含量，且T1效果更明显。相比对照CK，T1和T2均提高了土壤中放线菌门(Actinobacteria)的含量。

图4 不同菌肥量处理下细菌门水平相对丰度

在属水平上，排在前十的优势菌属分别为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、马赛菌属(Massilia)、Unclassified_f_Spor olactobacillaceae、Unclassified_o_Saccharimonadales、Unclassified_f_SC-I-84、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、Unclassified_f_uncultured、罗河杆菌 属(Rhodanobacter)、Unclassified_c_ Subgroup_6、芽孢杆菌属(Bacillus)。由图5 可知，T1相比对照CK，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)含量明显降低。本研究发现，T1处理马赛菌属(Massilia)含量明显高于CK 和T2。研究发现，芽孢杆菌属T1处理占比高于T2和CK 处理，类芽孢杆菌属与其类似。

图5 不同菌肥量处理下细菌属水平相对丰度

2.3 不同菌肥量处理对设施芹菜产量的影响

由表2可知，通过不同肥料处理下设施芹菜产量表现T1最高，为88.9 t·hm-2，与CK 相比提高了23.3 t·hm-2，且达到显著性差异。其次为T2处理，产量96.7 t·hm-2，比CK 处理提高了7.8 t·hm-2。说明不同菌肥量代替部分化肥处理对设施芹菜产量均有不同程度的提升。芹菜茎的粗纤维和维生素C含量，T1处理分别比CK提高了0.1%和1.3 mg·(100 g)-1。

表2 不同菌肥量处理对设施芹菜产量及部分品质的影响

3 讨论与结论

大量研究表明，不同肥料类型或用量与土壤微生物数量、组成及结构多样性差异之间紧密相关[12-15]。本研究发现，在门水平上，T1、T2处理下滋生土壤厚壁菌门。厚壁菌门表现为球状或者杆状，很多厚壁菌可以产生芽孢，可以抵抗脱水和极端环境。有一类厚壁菌，太阳杆菌科可以通过光合作用产生能量。研究发现，T1和T2处理降低了酸杆菌(Acidobacteria)含量。有研究表明，酸杆菌为贫营养细菌，多存在于营养贫瘠的土壤环境中，其丰富度与土壤质量呈负相关，且酸杆菌具有嗜酸性，其丰度增加土壤呈酸化[16-18]。放线菌的代谢活动能促进动植物等有机物质的分解，细化成作物可以直接吸收利用的有效磷、有效氮、有效钾等成分。研究发现，T1和T2均提高了土壤中放线菌门(Actinobacteria) 的含量。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)作为一种解磷菌，能够提高土壤中有效磷含量，增加土壤肥力，促进植物生长，缓解作物连作障碍。有研究发现，低浓度的鞘氨醇单胞菌液处理更能有效促进连作西瓜幼苗的生长，此现象可能由于菌株投加密度过大，导致生存空间不足，致使其菌内竞争加大，影响了根际微生物的群体效应[15]。本研究结果发现T1相比对照CK，鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)含量明显降低。马赛菌属(Massilia)具有参与碳氮循环、分泌生长素和酶、溶磷、降解多环芳烃菲、抗多种重金属等功能，在防治土传病害、修复土壤方面具有重要作用。本研究发现，T1处理马赛菌属(Massilia)浓度明显高于CK和T2。芽孢杆菌具有激活土壤、提高有机质分解能力、提高抗逆性、净化环境、抑制有害菌等功能。本研究发现，芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)浓度表现为T1处理最高，其次为T2处理，可能是因为菌肥中所含菌种为芽孢杆菌属，而施用量过高导致土壤孔隙度降低，土壤透气性差，反而不利于其繁殖。

微生物菌肥中有多种有益微生物，加速动植物残体的腐化和纤维素的降解，增加土壤有机质含量，分泌的胶性物质促进土壤团粒结构的形成，使土壤疏松。同时，微生物代谢产生的酸类物质促进土壤养分的分解，从而提高土壤肥力，提升作物品质，增加产量。本研究发现，T1和T2处理均不同程度地提升了芹菜的产量及粗纤维、维生素C含量。

通过研究不同微生物菌肥量替代部分化肥对设施芹菜土壤细菌群落结构多样性和产量的影响，结果表明，从Chao1 指数和Shannon 指数看出，T1和T2处理对土壤细菌丰度和多样性具有一定程度的抑制作用，且T1处理更明显；从PCA 分析可知，T1、T2处理与CK 处理间细菌群落结构存在差异性；从门和属水平分析土壤细菌群落结构，发现T1处理提高土壤芽孢杆菌等有益菌的浓度，且增加程度高于T2处理，这对修复土壤生态环境具有良好的效果；T1和T2处理提高了芹菜的产量和粗纤维、维生素C 含量，且T1效果更明显。综合考虑，T1处理对设施芹菜土壤细菌群落结构和产量的效果最佳。