FOXC2与上皮型钙黏蛋白对老年结直肠癌患者临床预后及细胞活性的影响

彭传林 曹惠 朱义生 刘龙 赵学军 陈丹

(宿州市第一人民医院 1普外科,安徽 宿州 234000;2内镜中心;3武汉大学基础医学院;4宣城市人民医院老年科)

结直肠癌是我国老年人群中高发的恶性肿瘤,其患病率逐年增加,是急需重点防治的疾病之一〔1〕。虽然随着近年来肿瘤治疗技术的快速进步,手术、放化疗等不断完善,但每年死于结直肠癌的患者数未出现明显下降,治疗方案选择的合理性是其中主要原因之一〔2〕。准确评估结直肠癌患者病情严重程度和预后是治疗方案合理制定的前提。叉头框蛋白(FOX)C2位于人类16号染色体,与对应配体结合后能够调控下游基因表达,在食管癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中呈高表达状态,促进肿瘤发展〔3,4〕,但在结直肠癌中的表达特点及作用的研究仍十分少见。上皮型钙黏蛋白存在于人体上皮细胞表面,在细胞之间及细胞与基质之间的连接中发挥通讯作用〔5〕,其表达下降是引发上皮细胞去分化和高浸润性的关键环节〔6〕。本研究旨在探讨FOXC2与上皮型钙黏蛋白对老年结直肠癌患者临床预后及细胞活性的影响。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取2018年1月至2019年3月宿州市第一人民医院收治的老年结直肠癌患者84例。入选标准:①年龄≥60岁,经组织病理学检查确诊为结直肠癌;②首次确诊,无放化疗等抗肿瘤治疗史;③接受手术治疗,配合完成随访。排除标准:①合并精神性疾病者;②合并其他组织器官恶性肿瘤。其中男38例,女46例;年龄60～82岁,平均(67.58±5.61)岁;组织学分级:高分化34例,中分化32例,低分化18例;肿瘤直径:<5 cm 52例,≥5 cm 32例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期47例,Ⅲ～Ⅳ期37例;淋巴结转移48例;浸润深度:T1～T2 52例,T3～T4 32例。本研究经医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。

1.2细胞与主要试剂 人结直肠癌细胞系HCT116购于上海康朗生物有限公司。免疫组化检测试剂盒购于北京百欧泰生物有限公司;血清FOXC2检测试剂盒和血清上皮型钙黏蛋白检测试剂盒均购于上海谷研实业有限公司;胎牛血清,DMEM完全培养基购于上海铼博生化科技有限公司;CCK-8检测试剂盒北京拜尔迪生物有限公司;Transwell小室购于南京迅贝生物有限公司;鼠抗人FOXC2单克隆抗体,兔鼠抗人上皮型钙黏蛋白单克隆抗体,鼠抗人基质金属蛋白酶2单克隆抗体,鼠抗人基质金属蛋白酶9单克隆抗体及对应的二抗均购于上海恒远生物有限公司。

1.3免疫组化法检测组织标本中FOXC2、上皮型钙黏蛋白表达 留取手术切除的结直肠癌病灶组织及术中留取距离肿瘤病灶边缘5 cm以上的癌旁正常组织,石蜡包埋、切片。将石蜡切片烤片2 h,常规脱蜡,室温下加入二甲苯中静置10 min,无水乙醇中静置5 min,95%乙醇中静置5 min,双蒸馏水洗涤后室温下静置。高压修复抗原,磷酸缓冲液洗涤后滴加一抗,稀释倍数均为1∶500,4 ℃冷藏过夜,次日滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,室温下静置1 h,二氨基联苯胺(DAB)显色,复染、脱水、透明、封片。显微镜下观察FOXC2、上皮型钙黏蛋白阳性染色均为黄色、棕黄色、棕褐色,FOXC2定位于细胞质,上皮型钙黏蛋白定位于细胞膜,对阳性细胞比例和染色强度进行评分,两项乘积0～2分为阴性,3～9分为阳性。

1.4资料收集和血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白浓度检测 收集患者人口学特征及组织学分级、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移情况、浸润深度,术后对患者进行3年随访,收集生存情况。术前采集患者空腹外周静脉血,离心收集血清,酶联免疫吸附试验检测血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白浓度。

1.5HCT116细胞培养与转染 人结直肠癌细胞HCT116使用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基,在37 ℃ 5%体积的CO2培养箱中进行传代培养。将HCT116细胞接种于6孔板中,显微镜下观察细胞生长至80%融合时更换为不含血清的培养基。使用脂质体2000进行转染,siRNA制备由北京靖瑞百康生物有限公司完成。使用无干扰活性的siRNA转染HCT116细胞为阴性对照组,有FOXC2干扰活性的siRNA转染HCT116细胞为FOXC2低表达组,仅加入脂质体的HCT116细胞为空白对照组。

1.6CCK-8检测HCT116细胞增殖能力 取对数期HCT116细胞,按4×105/ml密度铺于96孔板中,并加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基100 μl,常规培养24 h进行同步化处理,根据分组转染细胞,每组设置8个复孔。转染24、48、72 h加入浓度10%的CCK-8试剂10 μl/孔,读取450 nm处的吸光度(OD)值。

1.7划痕实验检测HCT116细胞迁移能力 取对数期HCT116细胞,按6×105/ml密度铺于6孔板中,显微镜下观察HCT116细胞生长融合度超过90%时做垂直划痕,根据分组转染细胞,设8个复孔。常规培养细胞24 h,观察划痕宽度变化并拍照,测量划痕面积,计算HCT116细胞划痕的愈合率。

1.8HCT116细胞侵袭能力检测 将基底胶∶DMEM=1∶9稀释后加入Transwell上室,体积为50 μl,常规培养6 h,将HCT116细胞按6×105/ml密度加入Transwell上室;根据分组向Transwell下室加入相应的细胞培养基,继续培养24 h,结晶紫染色,光学显微镜下计数进入下室的细胞数量。

1.9Western印迹检测细胞中FOXC2、上皮型钙黏蛋白、基质金属蛋白酶表达 RIPA细胞裂解各组HCT116细胞的总蛋白,测定蛋白浓度,电泳后使用电转法将目标蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室温下封闭1 h,滴加一抗∶鼠抗人FOXC2单克隆抗体(稀释倍数1∶300),兔鼠抗人上皮型钙黏蛋白单克隆抗体(稀释倍数1∶500),鼠抗人基质金属蛋白酶2单克隆抗体(稀释倍数1∶100),鼠抗人基质金属蛋白酶9单克隆抗体(稀释倍数1∶100),鼠抗人GAPDH单克隆抗体(稀释倍数1∶1 000),4 ℃冷藏过夜,次日滴加二抗,稀释倍数1∶2 000,室温下静置1 h,电化学发光法(ECL)显影,读取条带灰度值。

1.10统计学分析 采用SPSS25.0软件进行方差分析、t检验、χ2检验及受试者工作特征(ROC)曲线分析。

2 结 果

2.1不同组织中FOXC2与上皮型钙黏蛋白表达情况比较 结直肠癌组织中FOXC2阳性率〔58例(69.05%)〕高于癌旁正常组织〔17例(20.24%)〕,上皮型钙黏蛋白阳性率〔14例(16.67%)〕低于癌旁正常组织〔65例(77.38%)〕,差异有统计学意义(χ2=42.692、39.057,均P=0.000)。

2.2不同临床病理特征患者FOXC2与上皮型钙黏蛋白表达水平比较 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移、浸润深度T3～T4的结直肠癌患者FOXC2阳性率明显升高,上皮型钙黏蛋白阳性率明显降低(P<0.01,P<0.05);FOXC2、上皮型钙黏蛋白阳性率在不同性别、年龄、分化程度、肿瘤直径的结直肠癌患者之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征患者FOXC2与上皮型钙黏蛋白阳性表达比较〔n(%)〕

2.3不同预后水平患者血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白浓度比较 随访3年期间,84例老年结直肠癌患者生存65例(77.38%)。死亡组血清FOXC2浓度〔(41.95±5.03)ng/ml〕高于生存组〔(8.29±1.51)ng/ml〕,上皮型钙黏蛋白浓度〔(84.60±8.25)U/L〕低于生存组〔(122.42±11.67)U/L〕,差异有统计学意义(t=28.219、32.751,均P=0.000)。

2.4血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白检测对患者临床预后的评估价值分析 ROC曲线分析显示,血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白检测对老年结直肠癌患者临床预后具有较高的评估价值(P<0.05);其中血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白联合检测的评估价值最高曲线下面积(AUC)=0.939〕,灵敏度和阳性预测值明显高于各指标单独检测。见图1、表2。

图1 血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白检测对患者临床预后的ROC曲线

表2 血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白检测对患者临床预后的评估价值分析

2.5各组结直肠癌细胞中FOXC2表达水平比较 FOXC2低表达组结直肠癌细胞中FOXC2 蛋白表达水平(1.15±0.13)低于阴性对照组(2.37±0.29)和空白对照组(2.41±0.35),差异有统计学意义(P<0.05),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组结直肠癌细胞中FOXC2蛋白表达的Western印迹

2.6各组结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力比较 FOXC2低表达组结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭水平均明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01);阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力及上皮型钙黏蛋白、基质金属蛋白酶水平比较

2.7各组细胞上皮型钙黏蛋白、基质金属蛋白酶表达水平比较 FOXC2低表达组结直肠癌细胞中上皮型钙黏蛋白表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组,基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

3 讨 论

目前临床已有手术、放化疗、免疫治疗、靶向治疗等多种抗结直肠癌治疗手段,准确评估患者病情和预后对治疗方案的合理制定,改善预后具有重要意义。FOXC2可影响细胞核中DNA转录,参与调控下游基因表达〔7〕;研究显示,FOXC2能够促进淋巴管和血管的新生,还作为上皮细胞间质转化过程中的诱导因子,促进恶性肿瘤细胞发生上皮细胞间质转化,提升细胞的转移和侵袭能力〔8〕。基础研究显示,FOXC2在肿瘤细胞中伴随间质表型蛋白高表达,而上皮型钙黏蛋白等上皮标志物低表达〔9〕。已在食管癌、乳腺癌中发现FOXC2高表达参与病情的进展,但在结直肠癌患者中表达的研究仍十分少见。上皮型钙黏蛋白是一种位于细胞连接面的跨膜糖蛋白,与钙离子形成二聚体,参与调控同型细胞的黏附过程〔10〕。人上皮细胞中上皮型钙黏蛋白是形成正常连接复合物的主要调节因子,与细胞骨架连接,胞外信号向胞内传递,细胞分化、生长密切相关〔11〕。

本研究结果提示,结直肠癌患者肿瘤组织中FOXC2高表达,上皮型钙黏蛋白低表达,可能参与肿瘤的浸润转移过程。本文老年结直肠癌患者生存率与相关研究报道中结直肠癌患者3年生存率75.8%、78.51%基本一致〔12,13〕,说明本地区老年结直肠癌患者生存率处于平均水平。本文表明,血清FOXC2、上皮型钙黏蛋白单独和联合检测对患者临床预后具有较高的评估价值,联合检测的评估价值最高,可用于老年结直肠癌患的预后评估,指导治疗方案的制定。

FOXC2在多种恶性肿瘤中高表达,促进肿瘤的浸润与迁移;还能够上调基质金属蛋白酶表达,维持血管稳定性,保证肿瘤生长过程中的营养供应〔14〕。FOXC2能够参与调控内皮细胞、肿瘤干细胞的分化方向,影响细胞增殖、迁移等过程〔15〕。本研究结果提示,下调FOXC2表达能够抑制结直肠癌细胞的生长、转移和扩散。细胞间的黏附作用分为细胞与细胞间的黏附、细胞与基质间的黏附两种类型;上皮型钙黏蛋白是细胞与细胞间黏附的主要调控因子,在肿瘤组织中低表达,能够促进肿瘤细胞的转移和侵袭〔16〕。肿瘤细胞迁移和侵袭过程需要基质金属蛋白酶降解相邻胞外基质来完成。基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9是与肿瘤转移关系最密切的基质金属蛋白酶家族成员,参与肿瘤的转移和侵袭〔17〕。本研究中下调FOXC2表达后结直肠癌细胞中上皮型钙黏蛋白表达升高,基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9表达下降,提示FOXC2可能通过作用于上皮型钙黏蛋白、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9参与结直肠癌细胞的迁移和侵袭过程。