山苍子优良雌株选择及综合评价

高恩婷，曾庆扬，谷战英，磨春丽，张春来，李 扬，冯楠可，熊荟璇

（1.中南林业科技大学 a.林学院；b.经济林培育与保护教育部重点实验室；c.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004；2.芦头实验林场，湖南 岳阳 410400）

山苍子Litseacubeba又名木姜子或山鸡椒，是樟科木姜子属的一种雌雄异株的落叶灌木或小乔木。是我国特有的一种具有多用途的木本香料树种[1]。目前，国内对山苍子的研究主要集中在山苍子资源调查[2]、苗木栽培利用[3]、产业发展[4-5]、山苍子油提取工艺[6]、精油提取和成分分析[7]，山苍子提取物的药理作用[8]等；国外对山苍子的研究主要集中在山苍子精油抑菌及抗氧化作用和相关基因表达等方面。关于山苍子优良家系和无性系[9-10]、品种选育和改良[11]工作方面的研究较少。因此，筛选山苍子优良种质并进一步进行人工栽培可减少对野生资源的直接利用，有利于保护山苍子野生资源，实现生态效益和经济效益之间的平衡[12]。

本试验自2010 年起，分别在广西、湖南、江苏、云南、湖北、江西、广东、福建、浙江和四川等地对山苍子进行了多次野外调查，共调查4 000 多株山苍子。通过科技人员辨别并结合母树表型和生长状况，初步筛选出1 500 株表现较好的山苍子母树，详细记载母树的地源位置（经纬度、海拔梯度、立地条件等）、树体生长情况等。采集其成熟种子带回育苗基地播种，并于第二年春季选取生长良好的幼苗在种植基地造林，编号挂牌，拍照存档，同时栽种一定数量的雄树（雄树种植分布均匀且数量保持在树木总株数的10%左右），采用相同的抚育管理措施。复选过程通过持续观测和记录山苍子苗木的补植情况、树龄、病虫害防治情况、抗病性、抗寒性、抗旱性、物候期特性、生长特性、结实特性、果实含油率及历年结实情况等指标。进入初果期后，种植基地内实地测定单株性状，再计算各性状指标的平均值。为避免结实大小年现象的影响，以连续3 年产量和相关经济性状的均值进行分析。将单株产量高于平均水平30%的单株作为高产量优树。每年7—8 月采摘果实，用水蒸气蒸馏法提取精油，测定其含油率。以各单株连续3 年含油率的均值为基础，先计算出初选群体的平均含油率，然后将含油率大于平均值1 倍标准差的单株作为高含油率优树。选出高产量、高含油率优树后，检测其果实精油中的柠檬醛含量，将柠檬醛含量高于群体柠檬醛含量水平30%以上的单株作为高柠檬醛含量优树。通过以上分析，筛选出15 株产量较高、含油率较高、柠檬醛含量较高的优树。然后进行决选：根据GBT 11424—2008 中对山苍子精油柠檬醛含量的要求和市场需求情况[13]，结合树体实际生长状况、过去连续3 年的单株产量和山苍子精油柠檬醛含量，从复选的15 株优树中筛选出9 株雌株，作为本试验的候选优树。本试验在已初步选取的9株山苍子候选雌株基础之上，通过对试验林地中的山苍子树体生长发育情况进行调查，对候选雌株的生长和经济性状指标进行了研究与探讨，并进行主成分分析及综合评价，在此基础上筛选出优良雌株，旨在为山苍子良种选育后续工作提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验地位于湖南省汨罗市，属于亚热带湿润性气候，年平均气温17℃，夏季平均气温28.9℃，热量充足，累计年平均日照时数为1 650.1 h；雨量适中，多年平均降水量为1345.4 mm，约65.6%的降水和70%～85%的总辐射集中在4—10 月。试验区为丘陵地貌，海拔为350～380 m，土壤为土层较深厚且有机质丰富的红壤。

本试验的9 株候选山苍子雌株于2014 年定植，定植行株距为4 m×3 m。于2020 年8 月初进行指标测定，此时9株候选山苍子雌株均已进入盛果期，性状表现稳定。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 山苍子候选雌株树体生长性状测量

对采集的山苍子候选雌株树体进行编号记录其株高、地径、东西冠幅、南北冠幅、结果枝长度及角度等生长指标[5,14]，分别用卷尺和游标卡尺进行测量。株高为地面树干生长最低处到树体最高点的距离；地径为离地面10 cm 处的树干直径；东西冠幅、南北冠幅分别为树体东西方向和南北方向上的最大水平距离；结果枝长度为5 个随机选取的结果枝长度的平均值；结果枝角度是用量角器测得的一级侧枝与树干的夹角。

1.2.2 山苍子候选雌株果实生长性状及精油产量

果实横纵径：各单株随机选取10 个果实，用游标卡尺分别测量果实横径（垂直于果实纵径最大距离的平均值）和纵径（果托基部到顶部距离的平均值）[15]。

单株产量：用电子天平称量各单株采摘下来的果实的质量，重复3 次取平均值。

果实单粒质量、百粒质量：单粒质量为各单株随机选取的10 个果实的平均质量；百粒质量为3组随机选取的100 粒山苍子果实的质量的平均值。

果实含油率：采用水蒸气蒸馏法萃取山苍子精油[15]。用电子天平称量100 g 左右的果实，根据料液比为1∶10 的比例在蒸馏烧瓶中注入纯水，蒸馏时间为2 h。蒸馏试验重复3 次，并取平均值作为果实的含油率。计算公式为：

1.2.3 山苍子精油成分分析

山苍子精油化学成分分析：取各处理山苍子果实精油50 μL，用无水乙醇定容到10 mL 容量瓶中，过0.22 μm 的滤膜，GC-MS 备用。各雌株的山苍子精油测定3 次平行实验数据，取平均值[15]。

气相色谱条件：色谱柱HP-5MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

程序升温：柱初始温度为60 ℃，保持2 min后以3 ℃/min 的速度升温到125 ℃，保持3 min后再以15 ℃/ min 的速度升温到280 ℃，保持至完成分析；载气为高纯度氦气（99.99%）；柱前压为57 kPa，流速为1 mL/ min；进样量为1 μL；溶剂延迟：2.5 min；进样口温度为220 ℃；分流比为1∶40。

质谱条件：离子源：EI 源；电离电压为80 eV，接口温度为250 ℃；采集质量范围：30～500 amu；四级杆温度为 150℃；离子源温度为200 ℃；接口温度为260 ℃。

1.3 数据处理

使用变异系数（CV）来描述单株间各性状的变异幅度，公式为：

式中：σp为性状标准差，X为性状均值[16]；

用Shanmon-Wiener 多样性指数描述群体性状的变异频率及变异程度，基本原理是对原始性状数值分级，利用数据的平均值(X)和标准差(σ)划分为10 级，从第1 级[Xi＜(X-2σ)]至第10 级[Xi＞(X+2σ)]，每0.5σ为一级，根据公式计算各性状的多样性指数。分析得到数据在每一级的相对频率，进而计算多样性指数，公式为：

式中：H＇为Shanmon-Wiener 多样性指数，Pi为某一性状分布于第i级别中的数量占总数的百分比，ln 指自然对数[17-18]。

采用Excel 2016 软件对9 株候选山苍子和果实的生长性状、果实产量及含油率等相关数据进行初步分析，采用SPSS 25.0 统计软件对相关指标进行差异显著性分析、相关性分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 山苍子优良雌株生长性状分析

9 株候选山苍子雌株的株高、地径、东西冠幅、南北冠幅、结果枝角度和结果枝长度这6 个生长性状如表1 所示，9 株候选山苍子雌株中株高由高到低依次为149 号＞47 号＞64 号＞163号＞59 号＞82 号＞107 号＞128 号＞19 号，变异系数为23.69%；地径由大到小依次为149 号＞107 号＞163 号＞59 号＞47 号＞82 号＞19 号＞64 号＞128 号，变异系数为27.73%；东西冠幅由大到小依次为：82 号＞47 号＞19 号＞59 号＞163 号＞64 号＞128 号＞149 号＞107 号，变异系数为30.21%；南北冠幅由大到小依次为59 号＞47 号＞82 号＞19 号＞163 号＞64 号＞128 号＞149 号＞107 号，变异系数为34.72%；结果枝长度由长到短依次为59 号＞64 号＞163 号＞82号＞19 号＞128 号＞107 号＞149 号，变异系数为31.69%；结果枝角度由大到小依次为163 号＞149号＞128 号＞107 号＞82 号＞64 号＞59 号＞47号＞19 号，变异系数为27.02%；9 株山苍子候选雌株结果枝角度变化幅度在25.67°～53.00°。差异显著性分析结果表明：9 株雌株的地径、株高、南北冠幅均差异显著，47 号的东西冠幅与82 号差异不显著；107 号单株的结果枝角度与19、47和64 号单株差异显著。59 号单株的结果枝长度与47、19、82、107、128、149 和163 号单株差异显著；株高、地径、东西冠幅、南北冠幅、结果枝长度和结果枝角度的变异系数较大，说明9 株候选雌株的树体开展程度有较大的差异性差，生长抗逆性强，具有较大遗传潜力；Shanmon-Wiener 多样性指数分布在1.44～1.85，数值较高，说明树体生长性状多样性丰富。

表1 山苍子雌株树体生长性状†Table 1 Growth characteristics of L. cubeba female plants

2.2 山苍子优良雌株果实性状分析

横纵径可以反映果实的大小，9 株山苍子候选雌株的果实横径如表2 所示，由大到小依次为64号＞47 号＞163 号＞128 号＞107 号＞19 号＞59号＞82 号＞149 号；果实纵径大小依次为107 号＞64 号＞163 号＞47 号＞59 号＞128 号＞19 号＞82 号＞149 号。横径大于平均值的有19、47、64、107、128 和163 号单株；纵径大于平均值的有47、59、64、107 和163 号单株。149 号单株果实最小，平均直径为5.61 mm；64 号单株果实最大，平均直径为6.70 mm。64 号单株的横径与59、82、149 号呈显著性差异，59 号单株的横径与其他8 个单株的差异均达显著水平；107 号单株的纵径最大与19、82、149、128 号差异显著。

表2 山苍子候选雌株果实性状分析†Table 2 The fruit growth characteristics of L. cubeba female plants

果形指数如表2 所示，依次为59 号＞107 号＞64 号＞163 号＞82 号＞47 号＞149 号＞128 号＞19 号；9 个候选单株的果形指数的平均值为1.11，其中，59 号单株的果形指数最大，与19、128 和149 号单株呈显著性差异。

如表2 所示，单粒质量由大到小依次为107号＞128 号＞163 号＞64 号＞47 号＞19 号＞59号＞82 号＞149 号；百粒质量依次为163 号＞47号＞128 号＞82 号＞107 号＞19 号＞59 号＞64号＞149 号；单株产量依次为64 号＞163 号＞47 号＞19 号＞128 号＞107 号＞82 号＞59 号＞149 号；单粒质量大于平均值的有19、47、64、107、128、163 号；百粒质量大于平均值的有19、47、82、107、128、163 号；单株产量大于平均值的有19、47、64、128、163 号。149 号单株的果实单粒质量和百粒质量最小，产量最少；64号单株产量最多。差异显著性分析表明：128 号单株的单粒质量最大，与19、59、82 号和149 号差异显著（P＞0.05）；163 号单株的百粒质量最大，与其他8 个单株的差异均达显著水平（P＞0.05）；64 号的产量最大，与其他8 个单株呈显著性差异。

横径、纵径和果形指数的变异系数都很低，变异范围小，说明遗传特性较稳定；单粒质量和百粒质量的变异系数小于产量的变异系数，单粒质量和百粒质量的变异幅度相对于单株产量的变异幅度较小，果实单粒质量和百粒质量的稳定性高于单株产量，单株产量的变异范围较大。

2.3 山苍子优良雌株果实含油率及精油成分分析

9 株候选山苍子雌株的含油率如表3 所示，含油率依次为163 号＞149 号＞163 号＞47 号＞19 号＞59 号＞128 号＞107 号＞64 号＞82 号；9 株山苍子候选单株的果实含油率为1.56%～2.80%，平均含油率为2.22%；82 号单株果实含油率最低，为1.56%，163 号单株果实含油率最高，为2.80%，82 号单株的果实含油率与其他单株呈显著性差异，果实含油率的变异系数较大，为18.39%，变化范围较大，多样性指数为1.87。对9 株山苍子候选雌株的果实精油的化学成分进行了分析，共检出42 种化学成分。其中，果实精油的化学成分包含烯烃、醇类、醛类和酮类。通过对不同组分的相对含量进行计算，其中匹配度大于70%的组分占总精油组分的97.54%～99.76%。9 株山苍子候选雌株的果实精油的共有成分为β-蒎烯（0.09%～0.58%）、芳樟醇（1.29%～2.16%）、(+)-香茅醛（0.82%～3.97%）、反式-4,5-环氧-蒈烷（1.39%～4.61%）、β-柠檬醛（27.20%～39.76%）和α-柠檬醛（29.82%～47.19%）。其中，有几株山苍子候选雌株果实精油含有特有成分：47 号单株精油中含有异胡薄荷醇；59 号单株精油中含有特有成分3,6-二甲基-1,5-庚二烯、香叶醇和没药醇；82 号单株精油中含有5-甲基-2-(1-甲基乙烯基)-4-己烯-1-醇；107 号单株精油中含有3-甲基-3-环己烯-1-醇；128 号单株果实精油中含有β-水芹烯、2-壬酮、(R)-氧化柠檬烯、2,6,10,14-十六碳四烯-1-醇和(Z,E)-金合欢醇。这些单株可以作为定向育种的材料进一步培育。

表3 山苍子雌株果实含油率及精油成分分析Table 3 Essential oil contents and main constituent analysis of L. cubeba female plants

由表4 可知，9 株山苍子候选雌株的精油成分中α-柠檬醛含量从高到低依次为163 号＞47 号＞64 号＞82 号＞19 号＞59 号＞128 号＞107 号＞149 号；β-柠檬醛含量从高到低排序依次为163号＞47 号＞59 号＞64 号＞19 号＞149 号＞107号＞128 号＞82 号；总柠檬醛含量从高到低依次为163 号＞47 号＞64 号＞19 号＞59 号＞82号＞107 号＞128 号＞149 号。α-柠檬醛含量大于平均值的有19、47、64、82、163 号；β-柠檬醛含量大于平均值的有47、59、64、163 号；总柠檬醛含量大于平均值的有19、47、64 和163号。163 号单株的α-柠檬醛含量与其他单株差异显著（P＜0.05），149 号单株的α-柠檬醛含量与其他单株差异显著（P＜0.05）；82 号单株的β-柠檬醛含量与其他单株差异显著（P＜0.05），59 号单株的β-柠檬醛含量与其他单株差异显著（P＜0.05）。山苍子雌株果实精油中的α-柠檬醛含量和β-柠檬醛含量的变异系数较大，分别为13.48%和16.21%，变异范围较大。

表4 果实精油主要成分及相对质量分数†Table 4 The main constituents in essential oil and their relative mass fraction

2.4 生长经济性状相关性

对9 株山苍子候选雌株的生长性状和经济性状指标进行了Pearson 相关性分析，结果表明：大多数山苍子候选雌株的性状之间相关性达显著或极显著水平。如表5 所示，山苍子横径与纵径、单粒质量、百粒质量、单株产量、α-柠檬醛含量和β-柠檬醛含量之间呈极显著正相关；与地径、株高、呈极显著负相关；与结果枝长度呈显著正相关。山苍子果实纵径与单株产量、单粒质量、百粒质量、β-柠檬醛含量、结果枝长度和果形指数呈极显著正相关；与α-柠檬醛含量呈显著正相关。地径与株高和结果枝角度呈极显著正相关；与结果枝长度呈极显著负相关；与东西冠幅和α-柠檬醛含量呈显著负相关。单粒质量与百粒质量、单株产量呈极显著正相关；与地径呈显著负相关。百粒质量与东西冠幅、α-柠檬醛含量呈极显著正相关；与地径、株高、最大净光合速率呈极显著负相关；与单株产量、结果枝长度呈显著正相关。单株产量与地径呈极显著负相关；α-柠檬醛含量与结果枝长度呈极显著正相关；与结果枝角度呈显著负相关；与β-柠檬醛含量呈显著正相关。南北冠幅与东西冠幅呈极显著正相关；与β-柠檬醛含量和结果枝长度呈显著正相关。东西冠幅与α-柠檬醛含量呈极显著正相关；与结果枝角度呈显著负相关。结果枝长度与果形指数呈显著正相关。山苍子果实含油率与β-柠檬醛含量呈极显著正相关。α-柠檬醛含量与β-柠檬醛含量呈极显著正相关；与结果枝长度呈显著正相关。

表5 山苍子雌株生长经济性状相关性†Table 5 Growth and economic characteristic analysis of L. cubeba female plants

2.5 生长及经济性状的主成分分析

本试验所观测的所有指标中共提取出4 个主成分，这4 个主成分累计贡献率达到85.571%，说明这4 个主成分基本能够反映出9 个山苍子单株的15 个性状指标的大部分信息，结果见表6。4 个主成分的贡献率分别为40.885%、17.843%、15.076%和11.768%，特征值分别为6.133、2.676、2.261 和1.765，对应较大的特征向量分别是果实横径、百粒质量、产量和果实纵径，因此，这4个指标可作为山苍子优良雌株筛选与评价的重要指标。

表6 主成分分析各主成分的特征值和贡献率Table 6 Eigenvalue and accumulative contribution rates of each principal component

2.6 综合评价及得分

具体得分及排名如表7 所示,综合主成分得分越高，说明该单株的总体性状表现越好。

表7 不同单株各主成分得分、综合得分及排名Table 7 Principal component scores,comprehensive scores and rankings of different individual plants

通过综合主成分得分排名所选择的163、47和107 号雌株3 个雌株的果实较大、产量高、精油总柠檬醛含量高、生长性状和经济价值的综合表现较好。

3 结论与讨论

3.1 结 论

3.1.1 山苍子优良雌株生长性状

本试验中，9 株山苍子候选雌株的生长性状有较大差异性。山苍子候选雌株的株高、地径、东西冠幅、南北冠幅、结果枝长度和结果枝角度的变异系数较大，分别达到了23.69%、27.73%、30.21%、34.72%、31.69%和27.02%，说明9 株山苍子候选雌株的树体开展程度有较大的差异性，其生长抗逆性很强，且具有较大的遗传潜力。多样性指数分布在1.44～1.85 且数值较高，说明树体生长性状多样性较为丰富。此外，9 株山苍子候选雌株的树体生长性状之间大多呈显著差异，整体的树冠开展有利于其开花结果。

9 株山苍子候选雌株的果实横纵径和果形指数的变异系数均较小，说明山苍子果实形态的遗传特性较为稳定。此外，9 株候选雌株在树体的结实程度和果实质量方面变异较丰富，其中山苍子单株产量有较为明显的差异。有研究发现山苍子果实形态的表型分化系数和变异系数最小（51.27%和6.60%），说明山苍子的果实形态是一个比较稳定的遗传性状[18]。

3.1.2 山苍子候选雌株经济性状

本试验中，山苍子候选雌株的果实精油的平均含量为2.22%，柠檬醛含量均值为68.89%，其中，47、59、107 和128 号的果实精油中含有特有成分，对这些可以进行定向育种的单株进行进一步的培育；19、47、64 以及163 号山苍子候选雌株的果实精油中的总柠檬醛含量的均值为68.89%，高出食品安全国家标准对于食品添加剂山苍子油（α-柠檬醛+β-柠檬醛≥66.0%）的要求[13]，说明以上4 株候选雌株的果实精油可以进行进一步的加工，用于山苍子油相关的食品添加剂。

3.1.3 生长性状及经济性状相关性

通过研究性状之间是否存在依存关系可以描述不同变量之间的相互作用和影响的程度[19]。通过相关性分析可以确定各个表型性状之间的关系，为进一步的育种工作提供理论依据。李红盛等[20]研究发现：生长性状可以作为山苍子果实精油某些成分的间接选择指标，其中分枝数较适合作为精油中柠檬醛含量的间接选择性状，胸径较适合作为单株产量的间接选择性状。本试验结果表明，山苍子果实的含油率与β-柠檬醛含量呈极显著正相关，单株产量与α-柠檬醛含量、结果枝长度呈极显著正相关，α-柠檬醛含量与结果枝长度呈显著正相关，说明结果枝长度可以作为精油中柠檬醛含量的间接选择性状。

3.1.4 山苍子候选雌株主成分分析及综合评价

主成分分析共提取出4 个主成分，累计贡献率达到85.571%。第一主成分主要与果实大小、质量和品质有关；第二主成分主要反映了果实在树体的分布情况；第三主成分主要与果实品质和树体外观生长性状有关；第四主成分主要与果实形态有关。综合主成分值得分越高，说明该单株的综合性状表现越好。综合主成分值得分排名前3 的是163 号单株（1.12）、47 号单株（0.49）和107 号单株（0.41）。因此，163、47 和107 号雌株是本试验筛选出的优株。

3.2 讨 论

谷战英等[7]研究发现产自株洲白马乡的山苍子果实精油含量最高，为3.35%，变异系数为4.78%，即最为稳定。本试验中山苍子果实精油的平均含量为2.22%，低于株洲白马乡果实精油含量。赵欧等[21]研究发现：凯里出产的山苍子挥发油中的柠檬醛含量最高，为35.14%；花溪和铜仁的山苍子挥发油中的香茅醛含量达到24%以上；此外，供试产地的山苍子挥发油中均没有发现石竹烯与其氧化物以及金合欢醇等组分。本试验的结论与赵欧不一致，本试验中山苍子候选雌株的果实精油中柠檬醛的含量均值为68.89%，高于凯里地区的山苍子挥发油柠檬醛含量；而香茅醛含量低于花溪和铜仁地区的山苍子挥发油；在部分山苍子候选雌株的精油中存在石竹烯与其氧化物以及金合欢醇等组分。

本试验主要研究了9 株山苍子候选雌株的生长及经济性状方面的差异性及相关性，并对山苍子候选雌株的相关性状进行了主成分分析及综合评价，筛选出本试验中的优良雌株。后期将继续深入研究9 株山苍子候选雌株的光合作用等，并根据适生性和高产性等对筛选出来的优良雌株进行无性系苗木繁育和引种试验，为进一步筛选山苍子优良雌株提供理论基础和生产指导。

目前关于山苍子优良家系、优良无性系、品种选育及改良方面的研究鲜见报道。关于山苍子优良树种方面的研究具有较大潜力，目前本课题组观测到的山苍子候选单株在物候期上的表现差异不大，后期也将进行实地研究调查是否有早花早实的雌株。在今后的研究中将参考最新的研究报道，通过联合提取的方法来提高山苍子果实的精油提取率。