厦门某医院2021年沙门菌血清分型及耐药机制初步研究

胡鲤萍，魏 娴，蔡芳芳，林燕芸，刘玲英

厦门长庚医院，福建 厦门 361028

沙门菌是影响人类生态行为活动的重要传染病病原菌之一，是引起感染性腹泻的常见病原菌，其普遍存在于自然界中，主要通过食物和水源引起人类感染，能引起伤寒、副伤寒或非伤寒性疾病。根据世界卫生组织（WHO）统计，每年沙门菌感染的病例约有9 000 万，其中死亡人数近15万人［1-2］。沙门菌感染呈现明显的季节分布［2］，由于沙门菌血清型非常复杂，根据沙门菌O相抗原和H 相抗原的不同组合，WKLM 抗原表将沙门菌分为2 500 多个血清型［3］，准确对沙门菌血清分型就显得尤为重要。目前，临床上常用于治疗沙门菌病的药物主要为三代头孢和氟荃喹诺酮类，但随着这些抗生素的大量使用，世界各地均出现了大量三代头孢和氟荃喹诺酮类耐药的沙门菌［4-5］，给临床治疗沙门菌病和食品安全带来巨大压力。本研究选取2021年厦门长庚医院分离的沙门菌株进行血清学分型、药物敏感性试验及对β-内酰胺和氟荃喹诺酮相关耐药基因进行扩增、测序和分析，了解其流行状况、病原学特征以及初步分析β-内酰胺和氟荃喹诺酮的耐药机制，为沙门菌病的防控及临床科学用药提供科学依据，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

选取2021年1—12月厦门长庚医院腹泻病例粪便培养的沙门菌分离株，共计50株。

1.2 主要仪器和试剂

沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS）平板、麦康凯平板、沙门菌血清（宁波天润生物药业有限公司，丹麦SSI）、VITEK 2 COMPACT 及配套的革兰阴性菌（Gramnegative，GN）生化鉴定卡及药敏卡（法国梅里埃GN13）。

1.3 方法

1.3.1 菌株的鉴定 将腹泻患者粪便标本接种于SS和麦康凯平板上，置于35 ℃，5% CO2培养箱中培养18～24 h，挑取疑似菌落，分离纯化，并经VITEK 2生化鉴定，符合沙门菌属的进行后期实验。

1.3.2 血清鉴定 根据WHO推荐的沙门菌O&H抗原标准化鉴定流程进行菌株血清型鉴定，并送至福建省疾病预防控制中心细菌室进行复核确认。

1.3.3 药敏实验 沙门菌对13种抗菌药物（氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和复方磺胺甲噁唑）的耐药性由药敏卡（法国梅里埃GN13）测定，折点判断依据2019年美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准［6］。多重耐药菌（MDR）定义：至少同时耐3种和（或）以上不同类型抗菌药物。

1.4 耐药基因筛查

1.4.1 模板制备 采用热裂解法，挑取数个纯菌培养的新鲜菌落于100 μL 纯水中，制成悬浊液。100 ℃煮沸10 min，12 000 r /min离心3 min，取上清作为反应模板，-20 ℃保存以备用。

1.4.2 聚合酸链反应（PCR）反应体系及条件 PCR 反应总体积为20 μL，其中2×Taq PCR MasterMix （TaKaRa 公司）10 μL，上下游引物（10 μmoL /L ）各1 μL，DNA 模板4 μL，dd H2O 4 μL。PCR 反应程序: 95 ℃预变性5 min，然后95 ℃30 s，50～57 ℃30 s，72 ℃30～60 s，进行33个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳条带与目标预计大小一致的送测序验证。

2 结果

2.1 菌株分离时间与人群分布特征

2021 年医院共分离沙门菌共50 株，均来源于临床病例，其中男29例，女21例。1—12月各月份均有沙门菌检出，其中，5—10 月份检出率较高，呈现夏秋季节性分布特征，见图1。

图1 不同月份及性别病例分布情况

2.2 分离株沙门菌血清群和型分布特征

经血清凝集O&H 抗原鉴定试验及查White-Kauffmann表，50 株沙门菌共分为B、C1、C2-3、D、E1 五个血清群，9 个不同的血清型，其中以鼠伤寒沙门菌占比最高48.00%（24/50），其次为肠炎沙门菌14.00%（7/50），其他型别的沙门菌亦有少量检出，见表1。

表1 50株沙门菌血清群/型分布特征

2.3 不同年龄沙门菌血清型分布情况

50 个检出沙门菌病例的年龄分布在2 个月～90 岁之间，3岁以下儿童检出率最高，为64.00%（32/50）；3岁以下儿童中检出最高的血清型为鼠伤寒沙门菌，占38.00%（19/50），其他各年龄段检出的沙门菌血清型分布，见表2。

表2 不同年龄血清型分布情况株

2.4 分离株药敏情况分布

50株沙门菌对氨苄西林（72.00%）、氨苄西林/舒巴坦（56.00%）、复方磺胺甲噁唑（36.00%）耐药率较高；菌株多重耐药（MDR）率为40.00%。对头孢他啶（12.00%）、头孢曲松（16.00%）、氨曲南（16.00%）、头孢吡肟（4.00%）、环丙沙星（22.00%）、左氧氟沙星（12.00%）、呋喃妥因（8.00%）较为敏感；未发现对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、厄他培南耐药的菌株，见表3。

表3 50株沙门菌的药物敏感性特征

2.5 分离株耐药基因筛查

2.5.1 超广谱β-内酰胺酶TEM和CTX-M基因 50株沙门共检出TEM 基因28 株，占总数的56.00%（28/50），28 株TEM基因阳性菌株均对氨苄西林耐药，占氨苄西林耐药菌株的77.78%（28/36）。CTX-M基因检出数为8，占总数的16.00%（8/50），8 株检出CTX-M 基因的菌株均对头孢曲松和氨曲南耐药，耐药表型与耐药基因型完全一致。另外，8 株检出CTX-M 基因的菌株中5 株同时检出TEM 基因。8 株CTX-M 基因测序结果在NCBI 比对表明，6 株为CTX-M-55型，2株为CTX-M-14型[7-10]。

2.5.2 喹诺酮耐药区（QRDR）基因突变与质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR）50株沙门中检出喹诺酮类药物耐药决定区（QRDR）存在gyrA 和gyrA 两个基因突变类型，检出gyrA基因突变株8株，其中2株同时发生parC基因突变。该8株菌株均为环丙沙星和左氧氟沙星不敏感株，占环丙沙星不敏感表型的61.54%（8/13）。gyrA 基因突变位点分别为第83和87位氨基酸，突变氨基酸类型分别为2株Ser83Tyr、2 株Ser83Phe、2 株Asp87Tyr、2 株Asp87Asn 和2 株Asp87Gly，其中2 株同时发生Ser83Phe-Asp87Gly 及parC:Ser80Ile 双突变。质粒介导的喹诺酮耐药基因（PMQR）aac（6'）-Ib-cr，oqxA，oqxB 在50 株沙门菌中的检出率分别为26.00% （13/50），12.00% （6/50）和12.00%（6/50），这些阳性基因在环丙沙星和左氧氟沙星耐药株和敏感株中均有检出[11-13]。

3 讨论

沙门菌是临床和食品公共卫生安全中常见的一种肠道食源性致病菌，可导致人类感染伤寒、副伤寒和急性肠胃炎等。据统计，我国70%～80%细菌性食物中毒均由沙门菌引起［14］。禽肉、蛋等食品污染是沙门菌感染的主要来源，随着抗生素的大量使用和滥用，临床分离株中也出现不同程度的耐药，尤其是临床治疗沙门菌的两类常用药物三代头孢和氟荃喹诺酮类，也出现了大量的耐药菌株，为此，加强临床沙门菌菌株的血清学分型、耐药监测及耐药机制的研究就具有了重要意义。

本研究中回顾性分析样本医院分离的50株沙门菌株，共分离出5个血清群（B、C1、C2-3、D、E1），其中以B群为最大占比52.00%（26/50），B群中以鼠伤寒沙门菌24株为最常见分离株：而D群中主要以肠炎沙门菌为主要分离株，这与国内其他学者研究一致［15-16］。本次分离的菌株中主要来源于3 岁以下，共分离到32 株（19 株鼠伤寒沙门菌、3 株肠炎沙门菌、3 株伦敦沙门菌、2 株斯坦利沙门菌、2株里森沙门菌、1株波茨坦沙门菌、1株纽波特沙门菌、1 株明斯特沙门菌）；60 岁以上有4 株（2 株肠炎沙门、1株伤寒沙门菌、1株里森沙门菌）；来源于3～60岁的有14株（2株里森沙门菌、4株鼠伤寒沙门菌、2株肠炎沙门菌、1株伦敦沙门菌、1株波茨坦沙门菌、1株纽波特沙门菌、2株肯塔基沙门菌、1株明斯特沙门菌）。这可能由于小于3岁以下儿童机体免疫系统尚处于发育过程中，对沙门菌抵抗能力比较差，而大于60岁老年人，往往由于基础性疾病以及身体机能的下降，也对沙门菌抵抗不足，成为沙门菌主要的攻击对象［15］，为此应加强婴幼儿及老年人沙门菌的健康监测，尤其在一些腹泻病例中，应加强沙门菌的分离培养。

本次分离的50 株菌株中，对氨苄西林的耐药达72.00%（36/50）、对氨苄西林/舒巴坦达56.00%（28/50），而TEM 基因检出28 株，占总数的56.00%（28/50），占氨苄西林耐药菌株的77.78%（28/36），提示氨苄西林的耐药主要可能由TEM 基因介导。部分氨苄西林耐药株未检出TEM基因，可能与其他如AmpC等耐药基因有关。50株菌对头孢曲松耐药和氨曲南耐药率为16.00%（8/50），这与CTX-M 基因的检出率一样，且其耐药表型与耐药基因型完全一致。这表明三代头孢耐药主要由CTX-M 基因介导，这也与菌株对头孢他啶耐药较头孢曲松较低符合，因为CTX-M 酶对头孢他啶水解能力较头孢曲松弱。测试菌株对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为22.00%（11/50）和12.00%（6/50），gyrA基因突变位点均为83位和87位氨基酸突变，这与陈晶等［5］在武汉社区沙门菌中检出的突变一致。

另外，本研究检出2株同时发生Ser83Phe-Asp87Gly和parC:Ser80Ile 的双突变株，通常认为双重突变会介导高水平的喹诺酮耐药，说明本地区已出现对喹诺酮高水平的耐药，应引起足够的重视。所有菌株对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、厄他培南，均为敏感菌株，这与李美华等［16-17］的报道基本一致。近年来，沙门菌多重耐药率越来越高，许多菌株呈现出不同的耐药程度，甚至出现多耐药现象，本研究分离的50 株菌株中也出现了20 株多重耐药性菌株，达40.00%，这也提醒研究者在临床分离的沙门菌存在比较严重的多耐药现状菌株，可能与患者在出现腹泻后未及时就诊而自行服用各种抗菌药物及抗菌药物有关［18-21］。

沙门菌感染是临床常见的腹泻病因之一，也是临床比较棘手的问题。为预防因抗生素的滥用而导致临床关注的多重耐药超级细菌的出现，临床微生物检验科应加强沙门菌分离培养、血清分型、耐药监测及耐药机制研究，为控制沙门菌临床指导提供依据。