多菌种联合发酵降低酱油二次沉淀的研究

郑二帅，曹 猛，梁兰兰，廖熙娜，李 娈

（广东美味鲜调味食品有限公司，广东中山 528400）

酱油起源于中国，距今已有超过2 500年的历史，在我国日常生活和食品工业中均扮演着极为重要的角色。随着人们生活水平的提高，酱油以其滋味纯鲜、醇厚的特性，已经成为佐餐点蘸、烹饪赠香添色的最佳帮手，成为家庭厨房中必不可少的调味品之一。酱油在经过加热、沉淀、过滤后包装销售，在货架期会有沉淀物析出，尽管不存在食品安全隐患，但会给消费者带来不好的感官体验，这种外观质量的显著差异严重影响消费者的购买选择[1]。为了减少货架期沉淀的产生，目前通用的方法是在灌装包装前采用多级沉淀过滤甚至膜过滤的方式，尽可能过滤掉沉降物及大分子物质，但过滤会带来损耗增加、酱油增香大分子物质减少等不利影响，降低酱油的风味及口感[2]。

本文从酱油发酵根源进行研究，旨在利用各种菌株的优势，从发酵结束后酱油体系的稳定性入手解决二次沉淀问题。米曲霉具有强大的产蛋白酶能力，黑曲霉产淀粉酶的能力较强，通过在制曲阶段控制温度，充分发挥两种菌株的能力，使曲料在两种菌种作用下发酵产生丰富的酶系，以促进大豆、小麦原料中的蛋白质、纤维、淀粉充分分解为氨基酸态氮、单糖、单脂类物质，减少多肽类物质量，提升原料分解率[3]。后发酵阶段添加乳酸菌、酵母菌，有利于降低酱醪体系的pH，同时抑制杂菌产酸和恶性酵母的生成[4]。本文通过大量试验，在制曲阶段使用米曲霉和黑曲霉菌种联合发酵制曲，在后发酵阶段添加耐盐酵母菌和乳酸菌，在有效降低酱油二次沉淀生成的同时，能明显提升原料利用率[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

酱油发酵原料非转基因大豆、精制小麦粉、食盐从市场采购；酱油专用M01米曲霉、H02黑曲霉、M21耐盐高渗透酵母菌、M31耐盐乳酸菌由广东美味鲜调味食品有限公司提供；葡萄糖、麦麸从市场采购。

1.2 仪器与设备

冰箱、超净工作台、生化培养箱、耐盐菌扩培系统、种曲机、NK式旋转蒸煮锅、拌料绞龙、发酵池、松曲机、自动出曲机、65 m³发酵罐、列管换热器、热沉罐和灌装机等。

1.3 方法

1.3.1 小试验证米曲霉混合黑曲霉制曲添加比例

（1）利用超静工作台、生化培养箱设备，培养M01米曲霉、H02黑曲霉菌种，培养成熟后，放置在冰箱中，供小试使用。

（2）小试制大曲。试验参数：总用种比例为混合料（黄豆+面粉）的0.04%。黄豆（以干黄豆计）∶面粉按照1∶0.3的比例，M01米曲霉和H02黑曲霉菌种配比分别按照9.5∶0.5、9.0∶1.0、8.5：1.5、8.0∶2.0、7.5∶2.5和7.0∶3.0配比进行试验，以中性酶活力、酸性酶活力和大曲消化率3项指标的检测结果作为判断依据，每个配比平行做5组，取结果平均值作为该组配比的结果。对照样：以正常大生产M01菌种培养大曲为对照样。

1.3.2 中试验证最佳配比制曲效果

根据1.3.1结果，取最优组合作为大曲中大试的试验参数，开展中大试试验。试验参数：总用种比例为混合料（黄豆+面粉）的0.04%，黄豆（以干黄豆计）∶面粉按照1∶0.3比例；试验量：1.5 t酵池，共投5条池进行验证；对照样：以正常大生产M01菌种培养大曲为对照样。

1.3.3 大试验证最佳配比制曲效果及酱油的货架期沉淀

按照1.3.2验证的最佳配比，以生产规模生产2批次大曲，投入2个60 m³发酵罐中进行后期发酵，验证大生产阶段大曲的质量指标情况及发酵天然油灭菌、过滤后放置6个月内出现的二次沉淀情况。试验参数：参照中试参数；对照样：以正常大生产M01菌种培养大曲及发酵天然油为对照样。

1.3.4 小试添加M21耐盐高渗透酵母菌、M31耐盐乳酸菌的最佳量

在晒场后发酵阶段，选取1.3.2步骤的试验大曲制作后发酵酱醪，酱醪盐水浓度为19°Bé，料水比为1∶2.0。按照正交试验，分别在第14天添加M31耐盐乳酸菌和第40天添加M21耐盐高渗透酵母菌，发酵120 d后，分离出发酵酱油，检测全氮、氨基酸态氮、浊度指标，经常规灭菌、过滤后灌装，观察货架期6个月内出现沉淀情况，并通过离心收集析出沉淀物的量进行分析，确定最佳添加量。对照样：以正常大生产M01菌种培养大曲发酵酱醪为对照样。

1.3.5 中大试验证添加M21耐盐高渗透酵母菌和M31耐盐乳酸菌的效果

在晒场后发酵阶段，根据1.3.3小试结果，开展中大试试验，酱醪盐水浓度为19.0°Bé，料水比为1∶2.0，发酵周期120 d。发酵结束后检测发酵酱油的全氮、氨基酸态氮、浊度指标；经灭菌、过滤后灌装，观察货架期出现沉淀情况。对照样：以正常大生产M01菌种培养大曲发酵酱醪为对照样。

1.3.6 指标测定方法

中性酶活力、酸性酶活力：SB/T 10317—1999；大曲消化率：Q/MWX 108456—2017；全氮、氨基酸态氮：GB/T 18186—2000；浊度：Q/MWX 108511—2019；沉淀量：每瓶（500 g）样品，以3 500 r·min-1离心20 min，倾倒液体后，滤纸上倒置1 min后称量。

2 结果与分析

2.1 小试验证不同M01米曲霉混合H02黑曲霉配比制曲结果

由表1可知，M01米曲霉与H02黑曲霉配比在9.0∶1.0时，大曲的总酶活力和消化率均最高，其中总酶活力3 106 U，为对照样的1.10倍；消化率为83.8%，为对照样的1.04倍。H02比例进一步增加后，大曲中性酶活力会逐渐降低，影响M01菌株性能，造成总酶活力降低。故M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0是最合适的，按照该配比进行中大试试验。

表1 M01米曲霉混合H02黑曲霉不同添加比例制曲结果

2.2 中大试验证最佳配比制曲效果

由表2可知，5个试验组总酶活力平均结果为3 037 U，为对照样的1.1倍，提升10%。消化率为83.7%，为对照样的1.05倍，提升5%。试验结果与小试结果基本保持一致。

表2 M01米曲霉混合H02黑曲霉最优组合制曲中大试结果

2.3 大试验证最佳配比制曲效果及酱油的货架期沉淀

由表3可知，大试生产的大曲总酶活力3 053 U，为对照样的112%，消化率为83.6%，为对照样的1.05倍，结果与中试结果基本保持一致，大曲消化率水平相比于对照组有明显的提升。

表3 大试生产大曲检测结果数据

由表4可知，试验大曲生产的天然油全氮提升1.74%，氨基酸态氮提升3.96%，浊度降低36%，6个月货架期沉淀降低42.9%。

表4 大试生产天然油结果及灭菌过滤后货架期二次沉淀量结果数据

2.4 小试M21耐盐高渗透酵母菌、M31耐盐乳酸菌最佳添加量结果

由表5可知，在不同添加量酵母菌和乳酸菌的组合试验中，在14 d添加2‰的M21乳酸菌和第40天添加2‰的M31酵母菌，所得样品的二次沉淀析出量最少，样品（500 g）放置6个月后，析出量为0.11 g，为对照样（0.85 g）的12.9%。同比减少87.1%。该配比为最优配比，按照该配比进行中大试试验。

表5 不同添加量M31酵母菌和M21乳酸菌组合下的沉淀量

2.5 中大试验证添加M21耐盐高渗透酵母菌和M31耐盐乳酸菌的效果

按照M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0制曲后，以酱醪盐水浓度为19°Bé，料水比为1∶2.0投料，进行晒场环节后发酵，其中分别在第14天加入2‰的M21乳酸菌，第40天加入2‰的M31酵母菌，发酵周期120 d后，以自淋方式放出天然油，检测并经灭菌、过滤后装瓶。进行相关指标检测和观察，结果如表6所示。

表6 添加M21耐盐高渗透酵母菌和M31耐盐乳酸菌生产大试结果

由表6可知，生产大试结果与对照样相比，天然油全氮提升4.1%，氨基酸态氮提升5.9%，浊度降低60%，6个月货架期沉淀降低86.9%。试验结果与小试基本一致。

3 结论

在制曲阶段，以M01米曲霉∶H02黑曲霉=9.0∶1.0的比例制曲，能显著提升大曲酶活力和大曲消化率，制备的大曲在晒地发酵阶段，分别在第14天和第40天添加2‰的M21乳酸菌和M31酵母菌，能显著改善酱醪的发酵环境，促进大分子结构多糖向单糖和单酯转化，确保天然油体系的稳定性[6]。综合影响，货架期沉淀降低86.9%，同时蛋白原料向氨基酸态氮转化率提升5.9%，效益明显。在降低酱油货架期二次沉淀的同时，提升了原料的转化效率。

米曲霉与黑曲霉联合发酵，能充分利用米曲霉蛋白酶能力和黑曲霉产淀粉酶的能力，相互促进，增强了酶系的宽度和广度。将原料中蛋白质和淀粉、糖类物质分解成小分子物质，利于美拉德反应的进行，在发酵阶段前期添加乳酸菌物质，能迅速降低酱醪的pH，抑制杂菌的生长和对原料的消耗[7]。发酵第40天时添加酵母菌，能促进体态的后熟，促进大分子结构多糖向单糖和单酯转化，使体系向着小分子化方向转化[8]。本研究成果的应用能显著提升酱油的货架期质量，提升原料利用率，在节能降耗环保方面，有着明显的优势。