企鹅珍珠贝足丝蛋白3基因的克隆及其表达分析

杨 蕾,陈 一,张佳谊,战 欣

( 海南大学 海洋学院,南海海洋资源利用国家重点实验室,海南 海口 570228 )

企鹅珍珠贝(Pteriapenguin)属软体动物门双壳纲珍珠贝科珍珠贝属,国外称其为翼形珍珠贝。其生长环境为热带、亚热带海域,在我国主要分布于广西、广东、海南和台湾等地[1-2]。企鹅珍珠贝为大型珍珠贝类,生长速度快、成活率高,且具有较高的食用价值,是我国海水珍珠养殖主要经济种类之一,同时也可以作为海洋环境监测的参考生物[3-4]。

足丝是一种具有独特柔韧性、自愈合性和水下黏附性的生物材料,企鹅珍珠贝具有发达的足丝,通过足丝附着在基质表面营固着生活,从而适应不同的环境[5-6]。足丝中富含各种蛋白质成分,称为黏附蛋白,目前自海洋贻贝鉴定出的足丝蛋白数量有限,分为4类[7]:贻贝足丝蛋白、前胶原蛋白[8-10]、足丝纤维近端基质蛋白[11]、多酚氧化酶[12],可能还有其他蛋白参与足丝产生过程及其调控[13-14]。Sansoucy等[14]在紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)和加利福尼亚贻贝(M.californianus)足和足丝中鉴定出了潜在的与足丝形成相关的蛋白质,除上述已发现的黏附蛋白外,还从足丝中发现并鉴定出足丝蛋白3(BP3),该蛋白作为足丝本身的主要成分被检测出来。同时,沼蛤(Limnopernafortunei)中也检测出BP3基因,且BP3基因在足中特异表达,在足丝快速形成期高度表达,说明BP3基因的表达与足丝的再生密切相关,在足丝形成中起关键作用[15]。

目前对足丝蛋白的研究大多集中在贻贝科生物[16-22],对企鹅珍珠贝足丝蛋白进行分析的报道则较少。因此,笔者以企鹅珍珠贝为研究对象,采用RACE技术克隆BP3基因cDNA全长序列,利用生物学信息对其进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析BP3基因在各组织中的表达特征,为后续研究企鹅珍珠贝足丝黏附的分子机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用企鹅珍珠贝采自三亚蜈支洲岛,选取 1.5 龄健康贝,用干净的剪刀剪取3个个体的足、外套膜、闭壳肌、鳃、珍珠状袋、唇瓣等组织,保存于RNA保存液中用于RNA提取。将剩余的贝暂养在海南海昌虾苗繁育基地(海南文昌)14 d后,剪断企鹅珍珠贝的足丝,72 h后,收集分泌足丝个体的足(3个)和未分泌足丝个体的足(3个),保存于RNA保存液中备用。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

试验所用引物见表1。

表1 足丝蛋白3试验所用引物Tab.1 Primers used in the BP3 experiments

1.2.2 BP3基因全长克隆

按照Invitrogen公司Trizol试剂盒说明书提取企鹅珍珠贝足总RNA,并通过PrimeScriptTM反转录PCR试剂盒将其反转录为cDNA第1条链,-20 ℃备用。按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM逆转录酶(TaKaRa,日本)说明书的3′RACE cDNA模板,SMARTer©RACE 5′/3′试剂盒(TaKaRa,日本)说明书的5′RACE cDNA模板,从企鹅珍珠贝转录组数据中找到1条注释名为BP3的Unigene序列,使用Primer 5.0软件设计企鹅珍珠贝BP3基因3′RACE和5′RACE特异性引物。以5′/3′RACE cDNA为模板,参照3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM逆转录酶和SMARTer©RACE 5′/3′试剂盒说明书进行RACE-PCR扩增。以BP3-Outer和BP3-GSP1为引物进行第1轮PCR扩增。PCR反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5个循环;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,5个循环;94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,20个循环;72 ℃ 10 min。以第1轮PCR产物为模板,BP3-Inner和BP3-GSP2为引物进行第2轮巢式PCR扩增。巢式PCR反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,20个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,将目的片段胶回收,连接到pMDTM18-T(TaKaRa,日本)载体上,转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α(TOLOBIO,中国)中,送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序。将得到的核酸序列与BP3 Unigene序列拼接,根据拼接结果设计3′和5′端引物,验证拼接序列的正确性,从而获得BP3的cDNA全长。

1.2.3 BP3基因生物信息学分析

通过ORF Finder工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder),推导企鹅珍珠贝BP3基因编码的氨基酸序列;采用SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和CDD工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)分析信号肽和结构域;用ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)对氨基酸组成、分子式、等电点等理化性质进行预测和分析;利用NetNGlyc 1.0 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、NetOGlyc 4.0 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)和NetPhos 3.1 Server (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service. php?NetPhos-3.1)对蛋白的N-糖基化位点、O-糖基化位点和磷酸化位点进行预测;采用TMHMM Server v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白跨膜区域;利用ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析蛋白亲/疏水性;利用Protcomp 9.0(http:∥linux1.softb-erry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=proloc&topic=protcompan)对蛋白的亚细胞定位进行分析;采用SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和COILS Server(https:∥embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)对蛋白二级结构及卷曲螺旋结构进行分析;利用BLAST(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具和Custal X软件进行氨基酸序列相似性比对分析。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测BP3基因的表达特征

提取有足丝企鹅珍珠贝足、外套膜、闭壳肌、鳃、珍珠状袋、唇瓣6个组织的RNA,使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,日本)反转录第1链cDNA,进行实时荧光定量PCR检测。反应体系采用TB Green©Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa,日本)20 μL体系:TB Green 10 μL,上、下引物各0.8 μL,cDNA模板2 μL,加双蒸水至20 μL。以β-actin基因作为内参,以外套膜为对照,每组设3个平行。再分别提取有足丝企鹅珍珠贝个体足和无足丝企鹅珍珠贝足的RNA,反转录第1链cDNA,进行荧光定量PCR,每组设3个平行。反应程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环。采用2-△△Ct法计算相对表达水平,运用SPSS 26.0软件进行试验数据单因素方差分析,并用图基多重比较对平均值进行差异显著性检验,使用Excel 2016软件作图。

2 结 果

2.1 BP3基因的克隆与序列分析

2.1.1 BP3基因全长cDNA的克隆

使用3′RACE、5′RACE引物进行第2轮PCR扩增各获得了1条单一、明亮的条带(图1a、b),长度分别约为240、150 bp,将条带分别进行回收、测序,最终拼接得601 bp的cDNA全长序列。再使用全长验证引物扩增目的片段,观察在500 bp处有清晰、单一的目的条带(图1c),与预期结果一致。

图1 BP3基因克隆电泳结果Fig.1 Electrophoresis of amplified BP3 fragment from pearl oyster P. penguinM1.分子标记600 bp; M2.分子标记2000 bp; 1. 3′RACE扩增产物; 2. 5′RACE扩增产物; 3.全长扩增产物.M1.marker 600 bp; M2.marker 2000 bp; 1. 3′RACE producct; 2. 5′RACE producct; 3.full length product.

2.1.2 BP3基因序列分析

通过RACE-PCR技术获得BP3基因的cDNA全长序列(图2)。企鹅珍珠贝的BP3基因cDNA全长为601 bp,开放阅读框长453 bp,共编码150个氨基酸,该基因5′端非编码区为71 bp,3′端非编码区为77 bp。在BP3基因序列3′端非编码区含有1个Poly(a)典型信号序列(AATAAA)和终止子(TGA)。

图2 BP3基因cDNA及其编码的氨基酸序列Fig.2 Complete cDNA and deduced amino acid sequence of BP3 gene from pearl oyster P. penguin方框表示起始密码子和终止密码子; ▏表示分泌信号肽裂解位点;表示Poly(a)信号.The start codon and stop codon are shown in box; ▏indicates the cleavage site of secreted signal peptide; indicates Poly (a) signal.

2.2 BP3基因生物信息学分析

2.2.1 蛋白信号肽及结构域分析

使用SignalP 4.1 Server对足丝蛋白3氨基酸序列进行信号肽分析(图3a),发现原始剪切位点(C-score)和综合剪切位点值(Y-score)均在Lys23处呈现最大值,表明足丝蛋白3含有22个氨基酸残基(Met1～Gly22)的信号肽。而CDD工具分析(图3b)发现,在足丝蛋白3氨基酸序列中并不包含保守结构域。

图3 BP3基因所编码蛋白质的信号肽剪切位点(a)、保守结构域(b)Fig.3 The signal peptide splicing site (a) and the conserved domain (b) of BP3 from pearl oyster P.penguin

2.2.2 氨基酸理化性质预测分析

ProtParam氨基酸理化性质预测结果表明,企鹅珍珠贝足丝蛋白3蛋白分子式为C725H1134N202O228S15,由150个氨基酸组成,其中甘氨酸(Gly)含量最高,为11.3%,其次是半胱氨酸(Cys),为 9.3%,甲硫氨酸(Met)含量最低,为0.7%;带负电的氨基酸残基数(Asp+Glu)为18个,带正电的氨基酸残基数(Arg+Lys)为21个。相对分子质量为16.81 ku,其蛋白质的理论等电点PI值为7.33。蛋白质具有稳定性,不稳定系数值为31.40。总平均亲水性大小为-0.447,脂肪系数值为66.87。

2.2.3 蛋白糖基化和磷酸化位点预测分析

利用NetNGlyc 1.0 Server、NetOGlyc 4.0 Server和NetPhos 3.1 Server对蛋白的N-糖基化位点、O-糖基化位点和磷酸化位点进行预测,结果显示(图4),企鹅珍珠贝BP3有1个N-糖基化位点(Asn112),无O-糖基化位点;有16个磷酸化位点,其中丝氨酸9个(Ser7、Ser13、Ser30、Ser51、Ser55、Ser87、Ser101、Ser128、Ser138),苏氨酸3个(Thr29、Thr82、Thr139),酪氨酸4个(Tyr5、Tyr24、Tyr54、Tyr110)。

图4 BP3基因所编码蛋白质N-糖基化位点(a)、磷酸化位点(b)Fig.4 Predicted N-glycosylation site (a) and phosphorylation site (b) of BP3 from pearl oyster P. penguin

2.2.4 蛋白亲(疏)水性、跨膜结构和亚细胞定位分析

利用ProtScale分析蛋白生物亲(疏)水性,结果显示:企鹅珍珠贝足丝蛋白3疏水性最强出现在Ile10处,数值为2.789;亲水性最强在Gln39,数值为-2.178;大部分氨基酸表现为负值,推测其可能是一种稳定的亲水性蛋白(图5a)。蛋白跨膜结构域分析结果显示,足丝蛋白3蛋白不含跨膜结构域,整条多肽链均处于细胞膜外(图5b)。蛋白亚细胞定位分析结果显示,该蛋白分布于细胞外基质(9.81)、质膜(0.10)、细胞质(0.03)、线粒体(0.02)、溶酶体(0.03)的可能性较大,分布于细胞核、内质网、过氧化酶体、高尔基体、液泡的可能性为0(表2)。

图5 BP3基因所编码蛋白质的亲(疏)水性(a)、蛋白跨膜区(b)预测Fig.5 Predicted phosphorylation site (a) and protein transmembrane (b) of BP3 from pearl oyster P. penguin

表2 企鹅珍珠贝足丝蛋白3亚细胞定位预测Tab.2 Predicted subcellular location of BP3 from pearl oyster P. penguin

2.2.5 蛋白二级结构及卷曲螺旋结构预测

采用SOPMA蛋白二级结构进行分析,结果显示,该蛋白的二级结构中,α-螺旋占3.33%,β-转角占15.33%,延伸链占34.00%,无规则卷曲占47.33%,该蛋白中α-螺旋和β-转角相对较少(图6a)。通过COILS server对卷曲螺旋结构分析,数值在3个不同窗口下均较低,说明该蛋白可能不存在螺旋卷曲结构(图6b)。

图6 企鹅珍珠贝足丝蛋白3蛋白的二级结构(a)和卷曲螺旋结构(b)预测Fig.6 Predicted secondary structure (a) and oiled coil structure (b) of BP3 from pearl oyster P. penguin图a中的上图和中图为蛋白预测的二级结构分布和比例图,大写字母表示氨基酸,小写字母表示二级结构;下图为预测二级结构相似峰图.蓝色.α-螺旋(h);绿色.β-折叠(t);橘色.无规则卷曲(c);红色.延伸链(e).The distribution and proportion of predicted secondary structures are shown in upper and middle of fig. a, and the similarity peaks of predicted secondary structures are shown in bottom of fig. a; capital letters indicate amino acids and letters indicate secondary structures. Blue. alpha helix (h); green. beta turn (t); orange. random coil (c); red. extended strand (e).

2.3 BP3基因氨基酸同源性比对分析

利用BLAST工具和Custal X软件进行氨基酸序列相似性比对分析,结果显示,企鹅珍珠贝足丝蛋白3氨基酸序列与厚壳贻贝(M.coruscus,AKI87986.1)同源性最高,为30.34%(图7)。

图7 企鹅珍珠贝与厚壳贻贝足丝蛋白3氨基酸序列比对Fig.7 Amino acid sequence comparison of the BP3 between the pearl oyster P. penguin and mussel M. coruscus

2.4 BP3基因不同组织表达分析

有足丝企鹅珍珠贝各组织荧光定量PCR结果显示,BP3基因在6个组织中均有不同程度的表达,该基因的表达量在外套膜组织中最高,其次是鳃、唇瓣、足、珍珠状袋,在闭壳肌中表达量最低(图8a)。

图8 BP3基因在企鹅珍珠贝各组织中的表达量(a)和BP3基因在有(无)足丝企鹅珍珠贝个体足中的表达量(b)Fig.8 The expression level of BP3 gene in different tissues of pearl oyster P. penguin (a) and the expression level of BP3 gene in the feet of P. penguin with/ without the byssus (b)同行中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05).Means with different letters are significant differences(P<0.05), and means with the same letter are not significant differences (P>0.05).

有足丝和无足丝企鹅珍珠贝个体足的qRT-PCR分析发现:在有足丝的企鹅珍珠贝足和无足丝的企鹅珍珠贝足中均可检测到BP3基因的存在,且有足丝的足中表达量显著高于无足丝的足中表达量(P<0.05)(图8b)。

3 讨 论

3.1 企鹅珍珠贝BP3基因结构及氨基酸同源性比较分析

大量研究表明,不同物种的足丝蛋白存在较大差异,扇贝和贻贝虽同属双壳纲,但扇贝与贻贝的蛋白质组成存在显著差异,从栉孔扇贝(Chlamysfarreri)中鉴定出的7种足丝蛋白(Sbp1～Sbp7)及其相关蛋白与目前已知的贻贝足丝蛋白的同源性有限,仅与Mfp2具有低同源性(35%),其中Sbp1与CD109抗体同源性为29%,Sbp7与金属蛋白酶抑制剂2同源性为28%,与已知蛋白质序列同源性不高,表明它们可能具有不同的功能[23]。沼蛤足丝蛋白基因与其他贻贝的相似性很低,这些基因在双壳类中具有很高的物种特异性[15]。当前判定蛋白是否为足丝蛋白及相关蛋白主要是通过转录组学进行注释[14-15,23],笔者基于企鹅珍珠贝转录组序列从足中克隆得到全长601 bp的BP3基因,编码150个氨基酸残基,虽然氨基酸序列与目前已知的厚壳贻贝足丝蛋白3同源性仅为30.34%,但是企鹅珍珠贝足丝蛋白3与厚壳贻贝足丝蛋白3理化性质相似,分子质量和等电点均接近。企鹅珍珠贝足丝蛋白3分子质量为16.81 ku,而厚壳贻贝足丝蛋白3分子质量为15.00 ku;企鹅珍珠贝足丝蛋白3理论等电点为7.33,厚壳贻贝足丝蛋白3等电点为7.94;两种蛋白均为亲水性蛋白,无保守结构域,无跨膜结构。这说明两个物种的BP3氨基酸序列在空间结构上相似。已有研究发现,厚壳贻贝、斑马贻贝(Dreissenapolymorpha)、翡翠贻贝(Pernaviridis)等中发现多种足丝蛋白在进化水平上与紫贻贝并不相近,说明不同物种足丝蛋白的进化是相对独立的[23-26]。

3.2 足丝蛋白3的理化性质分析

藤壶胶由藤壶分泌,将藤壶与底物牢固结合,成熟个体所分泌的藤壶胶蛋白中含有高水平的丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丙氨酸[27]。在贻贝足丝蛋白产生黏附的过程中,L-3,4-二羟基苯丙氨酸发挥着重要的作用[28-29],L-3,4-二羟基苯丙氨酸是由多酚氧化酶(酪氨酸酶)使酪氨酸残基羟基化而形成的[13]。贻贝黏附蛋白的其他成分包含赖氨酸和甘氨酸。赖氨酸可能通过离子键与带负电荷的表面(如胶原蛋白和酸性多糖)形成黏附和邻醌分子间交联[30-31]。甘氨酸可能通过其赋予蛋白质结构开放的、扩展的构象促进黏附[13]。组氨酸是一种具有梯度模式的氨基酸,在足丝纤维远端高度富集,与贻贝的过渡金属含量(锌或铜)和附着力有关[32]。在企鹅珍珠贝足丝蛋白3中,甘氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸含量都较高,这些氨基酸将使得足丝蛋白3在足丝黏附过程中发挥重要作用。

蛋白质二级结构包括α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲。在企鹅珍珠贝足丝蛋白3的二级结构中富含延伸链和无规则卷曲,相对而言α-螺旋和β-转角的含量较少,判定足丝蛋白3为混合型蛋白质。由于足丝蛋白3无卷曲螺旋结构,且不具备跨膜结构,主要定位于细胞外基质、质膜、细胞质、溶酶体、线粒体中,因此判定该蛋白不具有膜蛋白结构特征,为膜外蛋白。糖基化和磷酸化是蛋白质翻译后修饰,在Mefp5中存在磷酸化丝氨酸,它在足丝黏附盘中的存在可能有助于贻贝与相邻贻贝之间的黏附作用[13]。本试验结果表明,足丝蛋白3中有1个N-糖基化位点,无O-糖基化位点,有16个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点9个,潜在的丝氨酸磷酸化位点可能有助于企鹅珍珠贝足丝黏附盘与相邻贝体的黏附。当蛋白中疏水氨基酸含量较少时,会产生较弱的疏水相互作用来促进与底物的结合[33],与厚壳贻贝相似,企鹅珍珠贝BP3基因所编码的氨基酸大多数均为亲水性氨基酸,疏水性氨基酸含量相对较少,这有助于足丝与底物发生黏附作用。

3.3 BP3基因的表达模式分析

当前对BP3基因的组织表达特性分析的研究相对较少,Li等[15]对沼蛤BP3基因进行组织表达分析发现,BP3基因在足中特异表达,且该基因的表达量与足丝的再生密切相关,表明BP3基因在足丝形成过程中起着关键作用。本试验中,企鹅珍珠贝BP3基因在所检测的6个组织中均有不同程度的表达,在外套膜组织中表达量最高,其次是鳃、唇瓣、足、珍珠状袋,在闭壳肌中表达量最低。虽然该表达特征与沼蛤BP3基因在足中特异表达的结果有所不同,但是企鹅珍珠贝BP3基因在足中的表达量也不低,且BP3基因在有足丝企鹅珍珠贝个体足中的表达量显著高于无足丝企鹅珍珠贝个体足,表明该基因与足丝形成存在相关性,但是具体的功能需要进一步深入研究。

4 结 论

企鹅珍珠贝BP3基因cDNA全长为601 bp,编码150个氨基酸,蛋白分子质量为16.81 ku,等电点为7.33。企鹅珍珠贝足丝蛋白3无跨膜结构,是一种亲水性稳定膜外蛋白,与厚壳贻贝足丝蛋白3理化性质相似。BP3基因在足中有表达,且在有足丝个体足中表达量显著高于无足丝个体足(P<0.05),据此推测,BP3基因参与企鹅珍珠贝足丝形成过程。