GC-MS/MS法测定坎地沙坦酯片中的痕量N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺

李尚颖 刘慧颖 张丽 徐万魁

【摘要】目的：采用GC-MS/MS法测定坎地沙坦酯片中的2种基因毒性杂质N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亚硝基二乙胺（NDEA）的含量。方法：在程序升温条件下，于SHIMADZU SH-L-17Sil MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）中进行分离，使用多反应监测（MRM）模式检测，电子轰击电离源（EI）电离，同时对NDMA与NDEA进行定量检测。结果：NDMA、NDEA及相邻色谱峰之间的分离效果良好，在5～500 ng/mL线性关系良好，NDMA的定量限为4.86 ng/mL，检测限为0.97 ng/mL；NDEA的定量限为4.88 ng/mL，检测限为0.98 ng/mL。坎地沙坦酯片中均未检出NDMA、NDEA。结论：建立的方法稳定可行、高效简便，具有高灵敏度和高专属性，能且对仪器的污染少，可用于坎地沙坦酯片中NDMA、NDEA的质量控制及标准研究。

【关键词】GC-MS/MS；坎地沙坦酯片；基因毒性杂质；N-亚硝基二甲胺（NDMA）；N-亚硝基二乙胺（NDEA）

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.02.036

【基金项目】辽宁省自然基金（2020-MS-073）。

Determination of Trace N-Nitrosodimethylamine and N-Nitrosodiethylamine in Candesartan Cilexetil Tablets by GC-MS/MS

LI Shangying，LIU Huiying，ZHANG Li，XU Wankui*

（Liaoning Inspection，Examination and Certification Centre〔Liaoning Institute for Drug Control，NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drug/Shenyang Institute of Food and Drug Control〕，Shenyang 110036，China）Abstract：Objective：to detect the two genotoxic impurities including N-Nitrosodimethylamine（NDMA）and N-Nitrosodiethylamine（NDEA）in Candesartan Cilexetil Tablets by using a GC-MS/MS method. Method：the separation performed on a SHIMADZU SH-L-17Sil MS capillary column（30 m×0.25 mm，0.25μm）under temperature rising program. NDMA and NDEA were ionized by electron ionization and multi reaction monitoring（MRM）data acquisition mode was used to detect. Result：the separation among NMDA，NDEA and adjacent chromatographic peaks was effective and revealed good lineary in the range of 5～500 ng/mL. For NDMA，the limit of quantitation was 4.86 ng/mL and the limit of detection was 0.97 ng/mL. For NDEA，the limit of quantitation was 4.88 ng/mL and the limit of detection was 0.98 ng/mL. Neither of NDMA and NDEA were detected in Candesartan Cilexetil Tablets. Conclusion：The method is stable，feasible，effective，sample，highly sensitive and specific and has little pollution to the instruments. It can have applications in quality control and standard control of NDMAand NDEAin Candesartan Cilexetil Tablets.

Key words：GC-MS / MS；candesartan cilexetil tablets；genotoxic impurities；N-Nitrosodimethylamine（NDMA）；NNitrosodiethylamine（NDEA）

坎地沙坦酯是一种螺环化合物，在体内迅速分解成活性代谢产物坎地沙坦。坎地沙坦是新一代二苯并咪唑类可逆的、竞争性的血管紧张素2受体拮抗剂，通过与血管平滑肌AT受体结合而拮抗血管紧张素2的收缩[1]，从而起到降压作用。它可用于治疗各种急慢性高血压、冠心病。

N-亚硝胺类化合物是一类具有高致突变性和强致癌性基因毒性杂质，痕量水平即可直接或间接损害DNA，导致基因突变或产生癌变物质。2018年，华海药业生产的缬沙坦中含有遗传毒性杂质NDMA事件发生后，N-亚硝胺类遗传毒性杂质备受关注[2]。在2020年世界卫生组织发布的致癌清单中，有10余个短脂肪链的N-硝胺化合物被列为A类致癌物质。NDMA和NDEA为2A类致癌物质。

目前，亚硝胺类遗传毒性杂质的检测方法有GC-FID、GCTEA、GC-MS[3-5]等。尚未有对坎地沙坦酯片剂中的NDMA与NDEA进行测定的相关文献。因此，开发具有高灵敏度，能够排除原料、辅料干扰的测定坎地沙坦酯片中NDMA与NDEA的检查方法刻不容缓。本研究采用GC-MS/MS法测定坎地沙坦酯片中NDMA、NDEA，该方法结果准确且灵敏度高，为生产企业评估亚硝胺类杂质风险提供参考。

1材料

1.1主要仪器

气相色谱-质谱联用仪（气相：岛津GC2030，质谱：岛津TQ8050）；电子天平（厂家：METTLER TOLEDO，型号：XP205）；离心机（厂家：HITACHI，型号：CR22GII）。

1.2药品与试剂

NDMA对照品（含量为5 mg/mL，批号为LRAC9913）购于Supelco。NDEA对照品（纯度为100.0%，批号：51068-202103）购于中国食品药品检定研究院。二氯甲烷（色谱纯，批号：22085094，美国Fisher公司）；氢氧化钠（分析纯，批号：20210220，国药集团化学试剂有限公司）；水为屈臣氏蒸馏水；氦气（高纯度）。坎地沙坦酯片（批号：000039458，规格为8 mg，上海医药集团青岛国风药业有限公司）。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为SHIMADZU SH-L-17Sil MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）。柱温为程序升温：初始温度为40℃，维持0.5 min后，以每分钟20℃的速率升至200℃，再以每分钟60℃的速率升至250℃，维持3 min；进样口温度为250℃；进样量：1μL；载气为氦气，流速1 mL/min；电离方式：电子轰击源（EI）；离子源温度：250℃；采集模式：MRM；溶剂延迟：3.1 min。

2.2对照品储备液制备

取NDMA、NDEA对照品各约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精取1 mL置于200 mL量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

2.3供试品溶液的制备

取坎地沙坦酯片的细粉（约相当于坎地沙坦酯100.0 mg）至50 mL离心管中，加入溶解液（取氢氧化钠约40 g，加水500 mL溶解，再加入乙腈50 mL，用水稀释至1000 mL）20.0 mL，涡旋混合并震荡5分钟，精密加入二氯甲烷4.0 mL萃取，振摇5分钟，于10000 r/min离心5分钟，取下层（二氯甲烷层）作为供试品溶液。

2.4系统适用性试验

精密量取混合对照品储备液1 mL置于10 mL量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，取系统适用性溶液和空白溶液各1μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图1。结果表明，溶剂不干扰NDMA、NDEA的测定，且相邻色谱峰之间的分离效果良好。

2.5线性

精密量取混合对照品储备液适量，用二氯甲烷逐级稀释至1、5、10、25、50、250、500 ng/mL浓度，分别进样1μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表1。由表1可知，在5～ 500 ng/mL范围内，NDMA、NDEA浓度与峰面积线性关系良好，相关系数在0.9999以上。

2.6检测限和定量限

精密量取对照品储备液，用二氯甲烷逐步稀释，按“2.1”項下色谱条件，进样测定，记录色谱图，当信噪比（S/N）≈3时，为其检测限（LOD）浓度。当信噪比（S/N）≈10时，为其定量限（LOQ）浓度，结果见表1。由表1可知，NDMA的LOQ为4.86 ng/mL，LOD为0.97 ng/mL；NDEA的LOQ为4.88 ng/mL，LOD为0.98 ng/mL。

2.7回收率

取样品细粉（约相当于坎地沙坦酯100.0 mg）及8μL、80μL、160μL的混合对照品储备液至50 mL离心管中，按“2.3”项下方法进行处理，分别制得浓度为10 ng/mL、100 ng/mL和200 ng/mL的加样回收率供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各浓度的回收率。

结果表明，该方法回收率良好，低浓度的平均加样回收率为87.4%～100.0%，RSD为2.5%～8.3%（n=3）；中浓度的平均加样回收率为90.7%～101.4%，RSD为3.5%～5.9%（n=3）；高浓度的平均加样回收率为92.4%～100.5%，RSD为3.2%～5.9%（n= 3）。

2.8重复性

取本品，按“2.7”项下方法配制浓度为100 ng/mL的重复性试验样品溶液，共6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，将测定结果代入标准曲线计算NDMA、NDEA含量。结果表明，各成分重复性良好，RSD为3.4%～5.1%（n=6）。

2.9稳定性

取重复性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12 h时测定。结果表明，以二氯甲烷为溶剂，NDMA、NDEA在12 h内稳定，各成分峰面积的RSD为1.8%～3.9%。

2.10测定结果

取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样测定，记录色谱质谱图（图2）。结果坎地沙坦酯片中均未检出NDMA、NDEA，表明坎地沙坦酯片中NDMA、NDEA浓度均小于检测限浓度（1 ng/mL），即供试品中NDMA、NDEA浓度均小于0.04μg/g。

3讨论

配制浓度为5μg/mL的混合对照品溶液，通过产物离子扫描模式，进行m/z 40～200范围内的扫描，考察亚硝胺类基因毒性杂质对照品的质谱定量参数，包括定量离子对、定性离子对和碰撞能量的选择。优化后的MRM参数见表2。

4結论

本研究建立了GC-MS/MS法测定NDMA、NDEA，并完成相关方法学验证，并将所建立的方法应用于坎地沙坦酯片的检测中。本实验中坎地沙坦酯片中的NDMA、NDEA均未检出，说明坎地沙坦酯片中的NDMA、NDEA无安全风险。

【参考文献】

[1]袁婷婷，刘勇.AT1受体拮抗剂-坎地沙坦酯治疗高血压病及靶器官保护作用若干进展[J].世界最新医学信息文摘，2016，16（70）：75-76.

[2]吴兆伟，杜凯，王琳，等.GC-MS法测定缬沙坦中的N-亚硝基二甲胺[J].中国新药杂志，2019，28（20）：2478-2481.

[3]周刚，李鹏飞，高家敏.GC-MS/MS法测定阿莫西林原料药中12种N-亚硝胺类基因毒性杂质[J].中国抗生素杂志，2021，46（4）：291-296.

[4]文松松，牛冲，刘琦，等.气相色谱-质谱联用法测定盐酸二甲双胍及制剂中的痕量N-亚硝基二甲胺[J].中国医药工业杂志，2021，52（2）：244-249.

[5]吴兆伟，杜凯，王琳，等.GC-MS法测定缬沙坦中的N-亚硝基二甲胺[J].中国新药杂志，2019，28（20）：2478-2481.

【作者简介】

李尚颖，女，1986年出生，副主任药师，硕士，研究方向为药品质量标准研究。

通讯作者：徐万魁，男，1975年出生，主任药师，硕士，研究方向为药品质量标准研究与质量控制。联系电话：024-31266300。

（编辑：侯睿琪）