PAD4 介导的瓜氨酸化组蛋白在中耳炎发病进程中的机制研究

阿不拉江·托合提,程秀琴,古丽波斯坦·买买提艾力（新疆维吾尔自治区人民医院耳鼻咽喉科，新疆 乌鲁木齐 830001）

中耳炎在全世界范围内被认为是耳鼻咽喉科最常见的疾病之一，可分为急性中耳炎和慢性中耳炎[1]。其中慢性化脓性中耳炎（chronic suppurative otitis media，CSOM）作为慢性中耳炎的一种，其主要特征是持续性且严重的耳溢液，且病程通常在6 个月以上[2]，但是关于CSOM的发病机制仍缺乏进一步的研究。

瓜氨酸化组蛋白3（citrullinated histone H3，CitH3）指肽链中的精氨酸残基转化为瓜氨酸后的组蛋白，是一种表观遗传修饰后的产物，广泛存在于免疫和炎症相关的疾病中[3]。Makrygiannakis 等[4]通过免疫组织化学检查了类风湿性关节炎、肌炎、扁桃体炎和炎症性肠病的活检组织，发现炎症组织中的瓜氨酸的蛋白水平显著增加。Morita 等[5]在中耳炎患者的中耳液中检测到了CitH3，并发现其与疾病的严重程度呈正相关，表明CitH3 可能参与了CSOM 的发生发展。肽精酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deimidase 4，PAD4)可将精氨酸转化为瓜氨酸，其主要定位于细胞核并靶向组蛋白H3、H2A 和H4，对其进行瓜氨酸化[6]。在类风湿性关节炎中，PAD4 通过驱动细胞因子失调，促进炎症发生，并增加瓜氨酸化自身抗原的产生，从而加快疾病的发展[7]。然而，PAD4 是否可通过介导CitH3的生成来参与中耳炎的发病进程尚不清楚。

本研究通过检测中耳炎患者耳组织中的PAD4 与CitH3 水平，并构建CSOM 小鼠模型，初步评估PAD4、CitH3 与CSOM 的相关性，探索PAD4 是否通过介导CitH3 形成而影响CSOM 的发病进程，以期为CSOM 的预防及治疗提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 临床样本

选取于我院耳鼻咽喉诊疗中心接受中耳手术治疗的30 例CSOM 患者和30 例非中耳炎患者为研究对象。非中耳炎纳入标准：耳硬化或听骨链畸形需行听骨链重建术；双侧重度感音神经性耳聋进行听觉植入手术，主要行人工耳蜗植入术；无中耳炎史，且术前超薄颞骨断层CT 扫描显示中耳及乳突气房无任何可疑感染病灶；术前耳内镜检查鼓膜完整，无内陷及鼓膜感染。CSOM 纳入标准：有慢性持续间断的流脓病史，伴或不伴听力下降、耳鸣、眩晕等不适，并经耳内镜检查证实，出现复发性耳流脓性分泌物超过6 个月。将术中取材的中耳肉芽组织立即置于液氮冷冻，置于-80 ℃冰箱保存。本研究经我院伦理委员会批准（KY20220429117），所有患者或家属签署研究知情同意书。

1.2 实验动物

SPF 级雄性BALB/c 小鼠30 只（6～8 周龄，20～25 g）购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，动物生产许可证号：SCXK（新）2021-0001。所有小鼠于室温、自然光暗周期的环境中饲养，实验期间自由饮食、饮水。

1.3 主要试剂

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）购自上海生物制剂公司，乌拉坦购自上海易恩化学技术有限公司，PAD4 抑制剂cl-amidine 购自美国MedChemExpress 公司，ELISA 检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，BCA 检测试剂盒、TRIzol、逆转录试剂盒和SYBR Green 试剂购自上海翌圣公司，qRT-PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，PAD4 抗体、CitH3 抗体、p-P65、P65、GAPDH抗体购自英国Abcam公司，HRP标记的山羊抗兔IgG 抗体购自上海白鲨生物科技有限公司，RIPA组织细胞快速裂解液购自北京索莱宝科技有限公司，ECL试剂盒购自美国Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 CSOM小鼠模型的构建与治疗 随机将30只小鼠分为对照组、模型组和给药组，每组10 只。对照组不造模，模型组和给药组采用鼓室内少量多次注射LPS 制备CSOM小鼠模型：采用20%乌拉坦5 mL/kg进行腹腔内注射麻醉后，将15 μL的0.1 mg/mL LPS 经小鼠右中耳鼓膜前下方注入鼓室；24 h 后再次进行麻醉，注入15 μL的0.3 mg/mL LPS；24 h后注射15 μL的0.5 mg/mL LPS。小鼠正常喂养3 d 后，以耳内镜观察鼓膜情况，鼓膜破裂并见积液征则表示造模成功。建模成功后，给药组每日中耳注射5 mg/kg cl-amidine，模型组和对照组注射等量生理盐水。

1.4.2 听性脑干反应测试 小鼠完全麻醉后，将电极置于两耳间连线中点，参考电极插于给声耳垂下，地线插于对侧耳垂下，电极之间阻抗小于3kΩ。采用美国TDT公司TDTⅢ设备给声并采集信号。刺激声为click 声，强度10～90 dBHL，衰减间隔10 dB，在接近阈值时，衰减间隔5 dBHL。以出现较为明确的Ⅲ波作为反应测试的阈值。

1.4.3 Western blot检测PAD4、CitH3、p-P65和P65蛋白表达 提取患者和小鼠中耳组织中的总蛋白，利用BCA 试剂盒检测总蛋白浓度。SDS-PAGE 分离蛋白，之后转移至PVDF 膜上，脱脂牛奶封闭1 h，分别加入兔抗鼠PAD4（1∶800）、p-P65（1∶1 000）、P65（1∶1 000）、CitH3（1∶200）和GAPDH (1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，加入山羊抗兔二抗于37 ℃孵育1 h 后曝光显影，并使用Image J软件进行定量分析。

1.4.4 ELISA检测血清中PAD4、CitH3、IL-6和TNF-α含量 血浆样本制备：分别采集患者与小鼠的全血样本，置于抗凝管中，随后于4 ℃以3 000 r/min 离心10 min，取离心后的上清即为血浆样品。根据试剂盒说明书，检测患者与小鼠血清PAD4、CitH3、IL-6 和TNF-α含量。将标准品工作液和待测样品加入样品孔中，将覆膜覆在酶标板上，轻轻晃动混匀，37 ℃孵育20 min；弃去酶标板中液体，洗涤液洗涤5次，每次30 s，拍干，除空白孔，每孔加入酶标抗体，盖上覆膜，37 ℃孵育30 min，弃去液体，洗涤液洗涤5 次，每次30 s，拍干；在样品孔中加入显色剂A、B，盖上覆膜，轻轻振荡混匀，37 ℃避光孵育10 min；加入终止液终止反应，立即用酶标仪测定450 nm 波长处吸光度。根据标准品浓度对应吸光度制作标准曲线，并根据样品吸光度计算样品相应浓度。

1.4.5 qRT-PCR检测耳组织中IL-6、TNF-α mRNA表达 采用TRIzol 提取各组细胞总RNA。使用酶标仪检测总RNA的纯度和含量。按照qRT-PCR试剂盒说明书依次进行逆转录和qRT-PCR实验。qRT-PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性7 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 15 s，循环40 个周期。IL-6 引物序列：正向5'-CTGC AAGAGACTTCCATCCAG-3'，反向5'-AGTGGTATAGA CAGGTCTGTTGG-3'；TNF-α 引物序列：正向5'-CTGA ACTTCGGGGTGATCGG-3'，反向5'-GGCTTGTCACTC GAATTTTGAGA-3'；GAPDH 的引物序列：正向5'-AG GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向5'-TGTAGACC ATGTAGTTGAGGTCA-3'。采用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。

1.5 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0 软件对相关数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。使用Spearman法进行相关性分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CSOM患者PAD4和CitH3表达上调

Western blot 结果显示，与非中耳炎患者比较，CSOM 患者耳组织中PAD4、CitH3 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。ELISA 结果显示，与非中耳炎患者比较，CSOM 患者血清中PAD4、CitH3浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2a、b。Spearman相关性分析结果显示，CSOM 患者血清中PAD4和CitH3浓度呈正相关（R=0.363 6，P=0.000 4），见图2c。

图1 非中耳炎患者和CSOM患者耳组织中PAD4、CitH3表达水平比较

图2 非中耳炎患者和CSOM患者血清中PAD4和CitH3含量情况

2.2 抑制PAD4缓解CSOM小鼠症状

听性脑干反应测试结果显示，与对照组比较，模型组听性脑干反应阈值升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药组听性脑干反应阈值降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 小鼠听性脑干反应阈值比较

2.3 抑制PAD4降低CitH3表达

Western blot 结果显示，与对照组比较，模型组耳组织中PAD4、CitH3 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药组耳组织中PAD4、CitH3 蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。ELISA 结果显示，与对照组比较，模型组血清中PAD4、CitH3 浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药组血清中PAD4、CitH3 浓度降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图4 小鼠耳组织中PAD4、CitH3表达水平比较

图5 小鼠血清中PAD4、CitH3含量比较

2.4 抑制PAD4减轻CSOM小鼠炎症反应

qRT-PCR 结果显示，与对照组比较，模型组耳组织中IL-6、TNF-α mRNA 表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药组耳组织中IL-6、TNF-α mRNA 表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图6。ELISA 结果显示，与对照组比较，模型组血清中IL-6、TNF-α 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药组血清中IL-6、TNF-α浓度降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。

图6 小鼠耳组织IL-6、TNF-α mRNA表达比较

图7 小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比较

2.5 抑制PAD4拮抗CSOM小鼠NF-κB信号通路

Western blot 结果显示，与对照组比较，模型组耳组织中p-P65/P65 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，给药组耳组织中p-P65/P65蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图8。

图8 小鼠耳组织中p-P65蛋白激活水平比较

3 讨论

中耳炎的病程迁延，可引起注意力、认知感及听力下降，从而影响患者生活质量，严重者会引起颅内外并发症甚至危及生命[8-9]。CSOM 患者鼓膜穿孔后，脓液一方面侵蚀听骨链听小骨，听骨链骨质破坏引起传导性耳聋，另一方面脓液也会循内耳圆窗破坏内耳的微细结构，造成感音神经性聋[10]。目前关于CSOM的标准治疗虽然已经有了多种方案，但无论手术治疗还是保守治疗，约有41%患者经过各种内外科治疗后耳溢液仍然持续存在,因此迫切需要发现新的生物标志物用于临床疗法的开发[11]。

CitH3 与多种炎症疾病的形成有关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等[12]。PAD4作为脒基转移酶超家族的成员，可以催化组蛋白H3 的精氨酸残基瓜氨酸化[13]。有研究表明，CitH3是一种常见的炎症疾病标志物，细胞外CitH3 表现出高毒性，引起组织损伤，可能导致多器官衰竭并最终导致患者死亡。本研究结果显示，CSOM 患者的中耳液和血清中PAD4 和CitH3 含量增加，且二者表达呈正相关，表明PAD4 和CitH3 参与了CSOM 的发展，并提示PAD4 可能介导CitH3的形成。

有研究发现，引发CSOM 的致病菌主要是革兰氏阴性菌[14]，其产物LPS 可加剧CSOM 的发病与病程进展。80%的中耳渗液中可发现LPS[15]。cl-amidine是一种PAD4 抑制剂，可以抑制PAD4 的酶活性，降低细胞中CitH3 水平[16]。本研究通过少量多次向小鼠鼓室内注射LPS 构建CSOM 模型，然后通过中耳注射5 mg/kg cl-amidine 抑制PAD4 酶活性，结果表明，cl-amidine 治疗可以缓解CSOM 小鼠症状，恢复听力，并降低中耳组织和血清中CitH3 的水平，表明PAD4 可以通过促进CitH3形成而加重CSOM的发展。

CSOM 的病因较多，其发病率可能受传染性病原体变异、宿主解剖结构和免疫状态的影响[17]。在分子水平上，CSOM 是由促炎转录因子激活、炎症细胞因子产生和释放，黏液分泌增加、黏膜增生、白细胞浸润中耳腔等一系列复杂的生理过程驱动[18]。研究报道，NF-κB可通过刺激因子（病毒、肿瘤坏死因子、B细胞活化因子、淋巴毒素等）的活化诱导多种基因的表达，产生IL-6、TNF-α等多种细胞因子，参与炎症反应[19]。IL-6、TNF-α 作为促炎细胞因子，均参与了细菌性和非细菌性急性中耳炎的持续炎症过程[20]。Zhao 等[21]的研究发现，抑制PAD4可通过调节上皮细胞核p65定位来保护LPS 诱导的急性肺损伤。而本研究结果显示，使用cl-amidine 抑制PAD4 后，p-P65 蛋白表达受到抑制，cl-amidine 治疗可以降低CSOM 小鼠耳组织与血清中的IL-6、TNF-α 水平，缓解炎症反应。因此，PAD4 介导CitH3 生成可能通过活化NF-κB 信号通路，增加炎症信号因子来加重CSOM 进程，但具体的分子机制仍有待进一步研究。

综上所述，CSOM 患者血清中PAD4 与CitH3 含量增加，且呈正相关，PAD4 通过介导CitH3 形成加重了CSOM，抑制PAD4 酶活性可显著降低CitH3 的表达水平，并通过抑制NF-κB 信号通路抑制炎症细胞因子的表达。以上结果初步明确了PAD4 介导CitH3 形成在CSOM 中的作用，可为进一步探索CSOM 的治疗提供新的思路。