不同微生物菌剂对辣椒疫病防控效果及土壤细菌群落结构的影响

杜公福　黄永　黄大野　倪征平　李晓亮　彭家丽　刘维侠　戚志强

关键词：微生物菌剂；辣椒疫病；防控效果；土壤细菌群落

中图分类号：S436.418.1 文献标识码：A

辣 椒 疫 病 是由辣椒疫霉菌（ Phytophthoracapsici）引起的一种毁灭性的土传病害[1]，自该病在我国被发现以来，在有辣椒种植的省份均有发生与危害，可为害辣椒茎秆、果实、叶片等部位，常造成全株萎蔫死亡，一般可造成20%～30%的产量损失，严重时甚至绝收，辣椒疫病的防控已成为辣椒生产中亟需解决的重大难题[2-3]。辣椒是海南主要冬季瓜菜之一，种植面积约4×10⁴hm²，占冬季瓜菜种植面积的20%[4]，其产品主要在“两节”期间销往国内各大城市，因此，在农产品质量安全方面实行最严格的规定，为了杜绝农药残留超标，在2021 年海南省印发的《海南省化学农药化肥减量实施总体方案》中指出，到2025 年化学农药使用量较2020 年减少15%，在此背景下，寻找能够减少化学农药施用的高效防控辣椒疫病的手段成为辣椒产业可持续健康发展的关键。

目前，化学农药、轮作、嫁接等常规措施均能在辣椒疫病防控中起到一定的效果，但受到抗药性、农药残留与环境污染、土地因素、生产成本等问题的影响，在实际生产中均存在一定的限制[5-6]，而有益微生物的应用将不受这些因素的限制，是一种高效、绿色、环境友好的防控技术，符合产业发展的需求。因此，有效微生物菌剂的筛选和应用是辣椒疫病绿色防治的重要工作。近年来，许多研究表明，多种有益微生物对辣椒疫病具有生物防治作用，包括芽孢杆菌、木霉菌及放线菌等[7-10]。芽孢杆菌和木霉菌繁殖速度快、生命力强，在与栖居微生物竞争时，因有较强的定殖能力而具有明显的优势，并能产生有机酸、酶以及抗菌肽等丰富的代谢物，从而有效抑制病原菌生长[11-14]。韩永琴等[15]利用109 CFU/g 多黏类芽胞杆菌可湿性粉剂、25%嘧菌酯悬浮剂和68%精甲霜·锰锌水分散粒剂对辣椒疫病进行防效试验，防效分别为74.35%、71.54%和76.30%；胡建坤等[16]利用50%烯酰吗啉可湿性粉剂、687.5 g/L 氟菌·霜霉威悬浮剂和15%木霉可湿性粉剂对辣椒疫病进行田间防效试验，防效分别为65.08%、68.99%和67.04%，这些研究结果说明多黏类芽胞杆菌、木霉菌已经达到与化学农药同等的防治效果。

目前用于防治辣椒疫病的微生物菌剂较多，但防治效果的稳定性存在不确定性[17]，导致种植户选择困难；另外，已有的研究大多关注防病效果、地上部性状和基于传统方法可培养微生物群落分析[18]。而运用高通量测序技术可对辣椒根际中的细菌群落进行全面地鉴定分析，可更精准地挖掘出影响辣椒疫病防控效果的关键土壤微生物群落。基于本课题组前期收集、筛选获得对辣椒疫霉菌有较好抑制作用的枯草芽孢杆菌、哈茨木霉菌等6 种微生物菌剂，为了探究其对辣椒疫病的防控效果及其对土壤细菌群落结构的变化，本研究拟通过盆栽试验开展6 种微生物菌剂对辣椒疫病的防控效果研究，通过高通量测序技术分析辣椒根际土壤细菌群落结构的变化，以期明确不同微生物菌剂的防治效果及其对辣椒根际土壤微生物种群的影响，为应用微生物菌剂绿色防治辣椒疫病提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试微生物菌剂和化学药剂共7 种（表1）。供试菌株辣椒疫霉菌分离保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所冬季瓜菜研究中心。供试辣椒品种为海椒309，购于海南琼研瓜菜良种开发有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计试验于 2021 年11—12 月在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所五队科研基地大棚内进行。试验设9 个处理（表1），设3 次重复，每次重复4 株。将苗龄一致，4～5叶期健壮的辣椒幼苗移栽至装有土的栽培盆（14.8 cm×13.5 cm）中，移栽当天进行药剂灌根，A₁～A₆处理的药剂均稀释300 倍液，A₇处理的药剂稀释500 倍液，进行均匀灌根，每次每株灌根300 mL 药水，A₈、CK 处理等量清水，每隔5 d灌根1 次，连续2 次。待第2 次灌根后3 d 采用傷根法接种辣椒疫霉菌，A₁～A₈处理接种辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液10 mL/株（浓度10⁶个/mL），等量清水不接菌为对照（CK）。

1.2.2 病情调查与样品采集接种后 15 d 进行病情指数调查，辣椒疫病调查分级[19]。0 级：无病；1 级：幼苗根茎部轻微水渍状变褐，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；2 级：幼苗根茎部变水渍状褐色，发病部位长度1～2 cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；3 级：幼苗根茎部变水渍状褐色，发病部位长度超过2 cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；4 级：幼苗根茎部变水渍状褐色，并且茎秆有缢缩现象，除生长点外全部落叶或植株萎蔫；5 级：植株枯死。

辣椒幼苗移栽30 d 后采集土样。采集9 个处理辣椒根际土壤，每个重复取3 株混合土样为1个样本，每个处理取3 个样本，共27 个样本，分别用无菌袋封装，做好标记带回实验室，置于–40 ℃保存备用。将采集的27 个土样送至上海美吉生物医药科技有限公司，并采用高通量测序技术完成细菌群落的结构分析。

1.3 数据处理

1.3.1 计算发病率及病情指数

采用 Excel 2003软件对试验数据进行基本处理，计算发病率和病情指数。

1.3.2 土壤细菌群落数据分析 采用DPS软件进行方差分析。利用上海美吉生物医药科技有限公司提供的云数据分析平台I-sanger 进行辣椒根际土壤细菌多样性分析，构建物种组成群落图。细菌多样性指数选用Ace 指数、Chao 1 指数、Shannon 指数及Simpson 指数。Ace 指数和Chao 1指数是衡量物种丰富度的指数，数值的大小表示物种丰富度的高低，指数越大，说明物种的丰富度越高；Shannon 指数用于衡量物种多样性，而Simpson 指数表示在群落中随机抽样的个体属于同一物种的概率， 也用来衡量物种多样性，Shannon 指数越大，Simpson 指数越小，说明样品的物种多样性越高[20-23]。

2 结果与分析

2.1 不同微生物菌剂对辣椒疫病的防控效果

在接种后第15 天进行发病情况调查（表2），A1 处理的辣椒植株病情指数为13.33，防治效果为85.58%；A2 处理的病情指数为16.67，防治效果为81.97%；A3 处理的病情指数为48.33，防治效果为47.17%；A4 处理病情指数46.67，防治效果为49.12%；A5 处理病情指数为63.33，防治效果为30.60%；A6 处理病情指数为55.00，防治效果为39.86%；A7 处理的病情指数为68.33，防治效果为25.83%。结果表明，A1 和A2 处理具有较好的防治效果，防效均达80%以上。

2.2 不同微生物菌剂对根际土壤细菌群落结构的影响

2.2.1 根际土壤细菌多样性 A₁～A₆ 处理的辣椒根际土壤的细菌Ace 指数、Chao 1 指数和Shannon指数显著高于A₇ 处理（多菌灵），而Simpson 指数显著低于A₇ 处理，并且其他微生物菌剂处理之间无显著差异（表3）。本次测序各样本文库的覆盖率（coverage）均大于97%，因此，研究结果可以代表样本中微生物的真实情况，表明利用微生物菌剂对辣椒疫病进行防控不仅有助于显著提高辣椒根际土壤细菌的多样性，而且也有利于显著提高土壤细菌的丰富度。

2.2.2 基于门分类水平的优势菌群分析 基于门分类水平分析发现，A₁～A₆（微生物菌剂）、A₇（多菌灵）、A₈（辣椒疫霉菌）、CK 处理的辣椒根际土壤中共有的优势细菌门有12 个（图1）。其中，变形菌门（Proteobacteria）细菌占比最高，幅度在31.72%～37.73%之间；其他优势细菌中放线细菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）在各处理间的占比差异不大。但不同微生物菌剂处理均提高了变形菌门、拟杆菌门（Bacteroidota）的占比，尤其是A₁ 和A₂处理显著提高了变形菌门、拟杆菌门的丰富度；同时A₇处理改变了髌骨细菌门（Patescibacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、粘细菌门（Myxococcota）的占比，其中髌骨细菌门的丰度显著升高，而绿弯菌门（Chloreflexi）、厚壁菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、粘细菌门的丰度明显降低。

2.2.3 基于科分类水平的优势菌群分析 基于科分类水平分析发现（图2），A₁～A₆（微生物菌剂）、A₇（多菌灵）、A₈（辣椒疫霉菌）、CK 处理的辣椒根际土壤中组成占比大于1%的优势细菌科有16 个，还有占比小于1%的未知菌科（以others表示）。其中黄色杆菌科（Xan thobacteraceae）占比最高，幅度在5.36%～7.80%之间。而且黄色杆菌科、高温单孢菌科（Thermo monosporaceae）、微单孢菌科（ Micromonosporace ae ） 、Rhizobiales_Incertae_Sedis 、芽单胞菌科（ Gemmatimonadaceae）、Devosiaceae、热微菌科（Thermomicrobiaceae）、罗丹诺杆菌科（Rhodanobacteraceae）、生丝微菌科（Hyphomicrobiaceae）、鞘脂单胞菌科（Sphingomonadaceae）、类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）在A₁～A₆、A₈、CK 处理之间的占比差异不大。

A₁～A₆与A₇、A₈、CK 处理相比，在噬几丁质菌科（Chitinophagaceae）、类固醇杆菌科（Steroidobacteraceae）和微球菌科（Micrococcaceae）的豐富度均有提高，尤其是A₁和A₂处理，显著提高微球菌科、噬几丁质菌科和类固醇杆菌科的丰富度；A₁～A₆与A₈、CK 处理相比，降低了诺卡氏菌科（Nocardiaceae）和类诺卡氏菌科的丰富度。A₇处理改变了类诺卡氏菌科的占比，与其他处理相比，提高了类诺卡氏菌科的丰富度，而黄色杆菌科、诺卡氏菌科、高温单孢菌科、噬几丁质菌科、微单孢菌科、Rhizobiales_Incertae_Sedis、芽单胞菌科、热微菌科、罗丹诺杆菌科、生丝微菌科、鞘脂单胞菌科、类固醇杆菌科的丰度均明显降低。

2.2.4 基于OTU 水平的Venn 图分析 Venn 图主要用于统计多个样本中所共有和独有的可操作性分类单元（operational taxonanic units， OTU）数量。由图3 可知，A₁（枯草芽孢杆菌）、A₂（哈茨木霉菌）、A₇（多菌灵）、A₈（辣椒疫霉菌）和CK 处理的辣椒根际土壤中细菌总OTU 数量分别为3366、3379、2994、3406 和3365 个。其中，共有的OTU 有2032 个，A₁、A₂、A₇、A8 和CK处理的辣椒根际土壤中特有的细菌OTU 数分别为112、128、70、118 和100 个。由此结果表明，经过A₁、A₂处理增加了辣椒根际土壤中特有的优势细菌数量，特有优势细菌丰富度和多样性的提高可能是辣椒抗性提高的主要机制。A₇处理降低了土壤细菌丰富度和多样性，长期使用可能会造成土壤细菌的丰富度和多样性持续降低，土壤微生态失衡，进而可能引起土壤向易感病土壤发展的趋势。A₈处理也增加了特有的细菌数量，这些增加的菌群可能是引起细菌菌群稳态失调，与辣椒疫霉菌协同引起辣椒疫病持续发病的原因。

3 讨论

微生物菌剂药效的稳定性一直是研发者和使用者重点关注的问题，生防菌的活菌数、制剂加工、使用方法以及田间环境因素等都可能影响农用微生物菌剂的作用效果[24-27]。肖小露[28]利用枯草芽孢杆菌BS193 防治辣椒疫病，BS193 发酵液灌根后间隔0、24、48、72 h 后接种病原菌，9 d后各处理的防治效果分别为23.43%、41.25%、49.41%、51.44%，间隔48、72 h 后接种的防病效果均显著高于灌根后立即接种病原菌的处理。结果表明微生物菌剂需要一定时间进行定殖、繁殖或诱导作物产生抗性，才能更高效地防治靶标病菌。本研究采用灌根2 次后间隔72 h 接种病原菌，使供试的6 种微生物菌剂有充分的时间进行定殖和繁殖。但是，供试的6 种微生物菌剂对辣椒疫病的防治效果仍有较大差异，A₁（1×10⁸CFU/g枯草芽孢杆菌微囊粒剂）和A₂（1×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌水分散粒剂）处理的防效较好，防治效果分别为85.58%和81.97%；A₃（5×10⁸CFU/g 荧光假单胞杆菌颗粒剂）、A₄（淡紫褐链霉菌NBF715粉剂）、A₅（1×10¹⁰CFU/g 枯草芽孢杆菌可湿性粉剂）、A₆（3×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌可湿性粉剂）的防治效果分别为47.17%、49.12%、30.60%、39.86%。这些微生物菌剂对辣椒疫病防效的差异性可能与其生防遗传特性和药剂剂型有关。席亚东等[17]收集了30 株木霉菌并对辣椒疫霉菌进行防控研究，其中17 株菌为同一菌种（钩状木霉菌），平板对峙3 d 后抑菌率为0.09%～68.99%，施用木霉菌后30 d 盆栽防控效果为17.90%～71.70%，该研究结果表明，相同菌种不同菌株的生防效果存在差异，这可能与其生防遗传特性等有关。并且剂型对于生防菌的活性至关重要，起着保护、稀释或缓释有效成分，优化使用效果以及扩大使用范围等作用，虽然生防菌具有生防效果，但其不溶于水将会使其丧失生防效力，因此，生防菌需辅以助剂以保持其在分散或储藏过程中的活性状态[29]。相关研究表明，枯草芽孢杆菌在水剂和可濕性粉剂中，芽孢会随着储存期的延长，其存活率也逐渐降低，导致田间防效不稳定[30]。MA 等[31]研究表明，微胶囊剂型的枯草芽孢杆菌在室温条件下贮藏540 d 后，其存活率为87.53%，显著高于其可湿性粉剂的存活率（47.06%）。微胶囊剂是当前农药新剂型中技术含量最高的一种，具有抑制因多种环境因素（如光、热、空气、雨水、土壤）和其他化学物质等造成的分解和流失，提高药剂的稳定性和控制药效释放等功能，从而提高药剂的利用率，延长其持效期[32-33]。裴文亮等[34]开展了木霉菌水分散粒剂热储稳定试验，以可湿性粉剂木霉菌作为对照，经过热贮处理后（54 ℃、14 d），木霉菌可湿性粉剂的存活率仅为50%，而木霉菌水分散粒剂的存活率高达90%，由此可见，水分散粒剂对木霉菌孢子有很好的保护作用，增加了药效的稳定性。水分散粒剂是一种可在水中迅速分散的剂型，工艺技术含量也比可湿性粉剂高，其药剂粒径更小，在施用到作物或者是防治靶标上时，水分散粒剂更容易进入作物体内或抑制防治靶标[29]。笔者就我国已登记的枯草芽孢杆菌和木霉菌的剂型种类（截至2022 年9 月有效的单剂）[35]进行统计分析，可湿性粉剂占比为79.8%，水分散粒剂占7.1%，悬浮剂占6.1%，颗粒剂占2.0%，其他占5.0%（微囊粒剂、水剂、水乳剂等），与有益微生物的其他研究领域（如生防机理、生防菌筛选、生防菌培养等）相比，国内有关剂型的研究相对较薄弱，微生物菌剂杀菌剂剂型比较单一，主要为可湿性粉剂。因此，建议加强农用微生物杀菌剂剂型的相关基础研究，并通过新剂型的研发和原有剂型技术的优化，提高微生物杀菌剂的防治效果，降低其生产成本。本研究中，A₁（1×10⁸CFU/g 枯草芽孢杆菌微囊粒剂）和A₂（1×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌水分散粒剂）处理相对于其他4 种微生物菌剂处理的药效稳定性更好，这跟生防菌较好的生防特性和药剂剂型有一定的相关性。A₁和A₂处理具有较好的防治效果，防效均达80%以上，A₁处理与黄大野等[36]利用1×10¹²CFU/g 枯草芽孢杆菌水分散粒剂通过盆栽试验对辣椒疫病进行防治，防效为86.67%的结果相当。A₂ 处理的防效与张量[37]利用5.43×10¹⁰CFU/g 木霉菌可湿性粉剂对辣椒疫病的防治效果为83.89%的结果相当。

优良的微生物菌剂不仅具有良好的药效稳定性，应还具有影响土壤微生物多样性的能力，其作为外源功能微生物可以通过改变土壤原有微生物群落的组成和优势种群的数量继而达到防控病害的效果[38-39]。叶旻硕等[18]、涂璇等[40]在盆栽条件下，发现施用微生物菌剂和拮抗放线菌能影响辣椒根系微生物数量并控制辣椒疫霉菌的生长繁殖，从而降低辣椒疫霉菌对根系的侵染。这些研究均与本研究结果一致，经微生物菌剂处理的发病率均低于接种处理，同时本研究分析了A₁（枯草芽孢杆菌）、A₂（哈茨木霉菌）、A₇（多菌灵）和CK 处理的辣椒根际土壤中细菌门、科水平的丰富度，土壤细菌总OTU 和特有的细菌OTU，发现经A₁ 和A₂处理后，在门水平明显提高了变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）的丰富度，ZHANG 等[41]发现植物根系吸收了较高比例的变形菌（ Proteobacteria ） 和拟杆菌（Bacteroidota），它们在抑制病原菌和对环境胁迫的耐受性中发挥关键作用；在科水平显著提高微球菌科（Micrococcaceae）、噬几丁质菌科（Chitinophagaceae） 和类固醇杆菌科（ Steroidobacteraceae）的丰富度；与CK 处理相比，降低诺卡氏菌科（Nocardiaceae）和类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）的丰富度；土壤细菌总OTU 数量和特有的OTU 数量均高于A₇、CK 处理，结合这2 个处理的防治效果，细菌总OTU 和特有的OTU 丰富度和多样性的提高，增强了辣椒抵抗辣椒疫霉菌侵染的能力。此外，A₇处理，明显降低了土壤细菌总OTU 和特有的OTU 丰富度和多样性，这与ANDREOTE 等[42]的研究结果相似，农业系统中，化学农药的使用使农田中土壤微生物的生物多样性降低，对植物产生不利影响，微生物多样性降低后，病原菌能够更加快速地入侵植物根系。

4 结论

1 × 10⁸CFU/g 枯草芽孢杆菌微囊粒剂和1×10⁸CFU/g 哈茨木霉菌水分散粒剂对辣椒疫病有较好的防治效果，防治效果分别为85.58%和81.97%，使用后增加了辣椒根际土壤中特有的优势细菌数量，特有优势细菌丰富度和多样性的提高可能是辣椒抗性提高的主要机制。使用化学药剂多菌灵后降低了土壤细菌的丰富度和多样性，长期使用可能会造成土壤细菌丰富度和多样性持续降低，土壤微生态失衡，进而可能引起土壤向易感病土壤发展的趋势。本研究仅在盆栽条件下开展，今后将开展枯草芽孢杆菌和哈茨木霉菌微生物菌剂在田间复杂土壤生态环境中的应用研究，以进一步提升病害防控效果和明确相关防控机理。