中药调周对薄型子宫内膜患者Wnt/β-catenin 信号通路及临床妊娠结局的影响

李海霞 夏正明 苏宁 彭娅娅 王维 罗小欢 蔡美虹 夏薇

不孕症是一种以正常性交12 个月后临床妊娠失败为特征的疾病,未受孕。据估计,全球育龄夫妇的不孕症发生率在8%～12%［1］。对于女性不孕症的阻碍正常着床和妊娠的因素,胚胎和子宫内膜质量共担责任［2］。FET 在过去十年中随着手术适应证的扩大而急剧增加,部分原因是与较旧的慢速冷冻方法相比,玻璃化冷冻技术的改进［3］。FET 技术可以促进选择性单胚胎移植,减少卵巢过度刺激综合征,优化子宫内膜容受性,为植入前遗传学检测留出时间,并促进保存生育力。薄型子宫内膜被定义为在排卵当天,或在新鲜体外受精(IVF)周期中注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)当天,或在FET 周期中开始黄体酮治疗当天<7 mm［4］。在辅助生殖技术周期中,薄型子宫内膜的发生率约为2.4%,并且与较低的着床率和妊娠率有关［5］。研究表明子宫内膜厚度与循环雌激素增加直接相关［6］。此外,子宫内膜厚度与子宫内膜容受性有关,可以作为辅助生殖成功的预测指标［7］。故本研究针对薄型子宫内膜患者在FET 助孕前给予中药调周疗法,以活血化瘀为核心,以期达到祛瘀生新,提高胚胎着床率和临床妊娠率的目的。

1 资料与方法

1.1 试剂及仪器 SP 免疫组织化学试剂及Western blot检测试剂(武汉谷歌生物科技有限公司),β-catenin、Integrin β3 一抗(武汉赛维尔生物科技有限公司)。脱水机、包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；显微镜及成像系统(尼康,日本)；电泳仪(北京六一仪器厂)；灰度分析软件(Alpha innotech,美国)；Image J 图像处理软件(Adobe 系统公司,美国)。

1.2 一般资料 选取本中心2021 年3 月～2022 年9 月进入FET 周期的100 例薄型子宫内膜患者,年龄25～35 岁,月经周期28～32 d,未合并子宫肌瘤以及内外科合并症,近3 个月内未采用过激素治疗。将其随机分为中药调周组和对照组,每组50 例。另选取同时期50 例正常受试者作为正常组。

1.3 方法

1.3.1 治疗方案 三组均予HRT 方案准备内膜；中药调周组则在此基础上同时予中药调周,中药调周组在行FET 前,在辩证论治的基础上,给予3 个月经周期的中药周期治疗。

HRT 方案：患者于月经1～3 d 服用戊酸雌二醇或17p 雌二醇,初始剂量4 mg/d,连续口服5 d,剂量改为6 mg/d,连续口服5 d,然后超声检查子宫内膜厚度,根据检查结果适当调整用药时间及剂量,口服雌激素药时间<21 d。随后患者加用孕激素。当内膜厚度达到较为理想时根据患者情况可行内膜转化。雌激素戊酸雌二醇片(商品名：补佳乐)用药可遵循内膜准备方案,排除生化妊娠后逐渐减药至停药,常规内膜转化日后5 d 行FET。

1.3.2 药物 中药调周(包括经后增殖方和促黄体方),为广东一方制药有限公司生产。患者月经周期开始后给予促黄体颗粒加减,排卵期(子宫内膜增殖期)行FET,再给予促黄体颗粒加减。

经后增殖方：含有炙甘草6 g、党参15 g、当归6 g、川芎6 g、白芍12 g、白术12 g、茯苓12 g、菟丝子15 g、熟地12 g、杜仲15 g、鹿角霜10 g、山萸肉10 g、川椒3 g。煎成20 ml,制成颗粒剂10 g,相当于生药量134 g。1 包/d,2 次/d,分早晚服用,于排卵期起开始口服。月经的1～3 d 或发现妊娠则停药。1 个月经周期为1 个疗程,共观察3 个月经周期。

促黄体方：含有熟地15 g、山药15 g、枸杞15 g、山萸肉10 g、菟丝子15 g、鹿角胶10 g、龟板12 g、党参15 g、白术15 g、扁豆15 g、苡米15 g、茯苓15 g。煎成20 ml,制成颗粒剂10 g,相当于生药量167 g。1 包/d,2 次/d 分早晚服用,于经前口服到月经的1～3 d 停药,改服经后增殖方。患者若发现妊娠则继续开始服用。

1.3.3 组织来源 三组中,因胚胎情况或其他原因而取消移植的患者,在拟移植当天,采用一次性子宫内膜采集器获取子宫内膜组织做进一步的病理检查,以排除内膜病变,部分内膜组织使用4%多聚甲醛固定液固定,用于后续实验。

1.4 观察指标及判定标准 比较三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 表达；β-catenin、Integrin β3 mRNA 表达；β-catenin、Integrin β3 蛋白表达；比较对照组和中药调周组患者子宫内膜厚度、PI、RI、IR、PR。临床妊娠：FET 后5 周阴道B 超下可见孕囊及胎心者。胚胎着床数：临床妊娠确立后,B 超下检查到的着床胚胎总数。PR=临床妊娠例数/总例数×100%。IR=胚胎着床数/移植胚胎数×100%。

1.4.1 子宫内膜厚度的测定 经过一系列准备工作后,在二维超声模式下,显示患者的子宫正中矢状切面,清楚获得宫腔线后,在子宫最大纵断面距宫底2 cm 处,垂直于宫腔线,测量内膜厚度(子宫内膜与子宫肌层的回声界面的最大间距)。

1.4.2 子宫内膜血流参数的测定 用彩色显像功能表现子宫内膜动脉,在合适的血流频谱中测出连续的2～6 个波形图,计算内膜下PI、RI,连续测量3 次,取平均值。

1.4.3 免疫组织化学染色 固定后的子宫内膜组织,通过石蜡包埋切片,随后SP 三步法检测子宫内膜组织中β-catenin、Integrinβ3 表达。每张切片选择3～5 个高倍镜视野,利用分析软件测定实验各组平均光密度(AOD)值。

1.4.4 Western blot 法检测 提取患者的子宫内膜组织总蛋白,BCA蛋白浓度检测后,SDS-PAGE凝胶电泳,转膜后使用脱脂奶粉进行封闭,随后分别加入一抗孵育1 h 和二抗孵育1.5 h。显色剂显色后,软件分析目的条带灰度值。

1.4.5 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测β-catenin、Integrinβ3 基因 采用RNA 提取试剂盒,提取子宫内膜组织总RNA。逆转录后使用cDNA 进行实时定量PCR 检测β-catenin、Integrinβ3 在不同分组的子宫内膜组织中基因表达情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 表达比较 β-catenin 主要在子宫内膜基质细胞中表达。Integrinβ3 主要表达于子宫内膜腺上皮。免疫组化染色可见深浅不一的棕黄色颗粒沉淀。中药调周组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 表达分别为(0.286±0.031)、(0.292±0.023),均高于对照组的(0.201±0.035)、(0.198±0.056),差异均具有统计学意义(P<0.05)。中药调周组与正常组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 表达比较()

表1 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 表达比较()

注：与对照组比较,aP<0.05

2.2 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表达比较 中药调周组患者子宫内膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表达分别为(0.498±0.047)、(0.591±0.026),均高于对照组的(0.176±0.036)、(0.218±0.075),差异均具有统计学意义(P<0.05)。中药调周组与正常组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表达比较()

表2 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 mRNA 表达比较()

注：与对照组比较,aP<0.05

2.3 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 蛋白表达比较 中药调周组的子宫内膜β-catenin、Integrin β3蛋白表达分别为(0.999±0.074)、(0.978±0.089),均高于对照组的(0.080±0.057)、(0.130±0.068),差异均具有统计学意义(P<0.05)。中药调周组与正常组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 蛋白表达比较()

表3 三组子宫内膜β-catenin、Integrin β3 蛋白表达比较()

注：与对照组比较,aP<0.05

2.4 对照组与中药调周组患者子宫内膜厚度、PI、RI比较 中药调周组PI(1.43±0.32)、RI(0.74±0.31)均低于对照组的(1.87±0.12)、(0.96±0.21),子宫内膜厚度(8.97±1.23)mm 厚于对照组的(7.60±0.51)mm,IR 36.00%(18/50)、PR 56.00%(28/50)高于对照组的12.00%(6/50)、24.00%(12/50),差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 对照组与中药调周组患者子宫内膜厚度、PI、RI 比较()

表4 对照组与中药调周组患者子宫内膜厚度、PI、RI 比较()

注：与对照组比较,aP<0.05

3 讨论

中药调周法是以中医整体观为指导,采用补肾和活血调经交替的周期序贯治疗方法［8］。肾为先天之本,生殖之源,肾虚则胎孕难成,故治疗不孕症从肾入手,是古今医家公认之法。中医学认为“肝肾同源”,肝藏血,主疏泄,肝气条达则血脉流通；肝失疏泄,月经不调,则自然难受孕。血瘀是不孕症的另一个重要因素,因妇人多忧郁,气机不畅,气滞则血瘀,淤血阻于胞宫,两精不能结合,以致不孕。因此,补肾、调肝、活血化瘀为治疗不孕症的主要治疗方法［9,10］。本研究根据辅助生殖技术各环节的用药特点,并结合月经周期的规律性特点对患者加用补气血益肝肾的药物进行调理。促黄体颗粒、经后增殖颗粒周期性使用在本研究中作用显著,提高了患者的IR、PR。

人类子宫内膜在胚胎植入过程中起关键作用。当子宫内膜被评估为“薄”时,医生和患者将面临是否继续周期治疗的决定。子宫内膜厚度的测量是临床实践中最常用的方法。治疗子宫内膜薄的患者仍然是临床医生面临的一项重大挑战［11］。Wnt/β-catenin信号通路是胚胎发育和成人组织稳态再生所必需的,该信号通路是通过激活细胞质内的β-catenin,当β-catenin 水平低下时,Wnt 信号通路关闭［12］。研究显示,补肾活血中药可通过激活Wnt/β-catenin 信号通路作用于子宫内膜干细胞,改善薄型子宫内膜的厚度,从而影响妊娠结局［13］。此外Integrinβ3 的表达与子宫内胎儿的着床有着一定的关系,Integrinβ3 主要存在于子宫内膜腺上皮,在一定程度上可以反应子宫内膜容受性［14,15］。

本研究发现,FET 周期的薄型子宫内膜患者在FET 进行前,通过中药调周对患者进行3 个月的月经调理,可以提高β-catenin、Integrinβ3 在子宫内膜组织中的表达水平,同时治疗后患者子宫内膜的厚度明显增加,IR、PR 比对照组明显的增加,这可能与β-catenin 表达量的提高激活了Wnt 信号通路,从而对病理性薄型子宫内膜有进一步的修复作用。

综上所述,中药调周可能通过激活Wnt/β-catenin信号传导途径参与薄型子宫内膜的修复,促进子宫内膜容受性的建立,进而改善FET 周期中薄型子宫内膜患者的妊娠结局。