长链非编码RNA Linc00511在肺癌血清中的表达及临床诊断价值

霍艳，郭红艳，徐亚茹，李耕慧，孙晓杰，赵正林，吴琦，刘波

1.齐齐哈尔医学院医学技术学院，黑龙江齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院附属第一医院检验科，黑龙江齐齐哈尔 161006；3.齐齐哈尔市第一医院老年科，黑龙江齐齐哈尔 161000；4.齐齐哈尔医学院附属第二医院办公室，黑龙江齐齐哈尔 164000

肺癌（lung cancer）是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率高居世界首位，且其发病率在相当长的时间内将继续呈上升趋势。尽管肺癌治疗手段在不断更新，但该病总体预后仍然较差[1]，这与肺癌的发病机制不清，缺乏有效的早期诊断和预防手段有关[2]。研究发现，肿瘤细胞中的某些特定LncRNA表达水平会发生异常改变，LncRNA有可能成为癌症早期诊断的潜在生物学标志物和药物治疗靶点[3-4]。Linc00511在多种肿瘤中表达失调，与人类恶性肿瘤的预后和转移相关，本研究通过实时荧光定量PCR方法检测2017年9月—2018年2月期间，在中国医学科学院肿瘤医院住院的60例肺癌患者及79名同期来院体检的健康人血清中Linc00511的表达，分析其表达水平与临床因素的关系，并评估其作为血清学标志物在肺癌临床诊断中的应用价值。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究回顾性采用本院79名健康人对照组血清样本和60例肺癌组患者血清样本为研究对象，对照组中男48名，女31名；平均年龄（56.43±9.07）岁。肺癌组中男35例，女25例；平均年龄（53.73±7.61）岁。入选对象一般资料组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：肺癌病例经病理诊断确诊；收集血清样本前未进行手术、放疗和化疗等相关治疗；病例临床诊断和肿瘤分期均按照美国癌症联合委员会癌症的肿瘤-淋巴结-转移（tumor-nodemetastasis，TNM）分期系统第六版或组织活检及影像学检查确定。排除标准：有肝、肾功能异常及其他严重基础疾病、恶性肿瘤者。

1.3 方法

1.3.1 血清标本收集 收集所有研究对象静脉血5 mL，室温静止1 h后，4℃，3 500 r/min离心10 min，用新管收集上层血清，4℃，12 000 r/min离心10 min，除去细胞碎片，将样本置于-80℃冰箱中冻存。

1.3.2 RNA提取与逆转录 采用Trizol LS试剂（美国Invitrogen公司）从血清中提取总RNA，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR试剂盒（日本Takara公司）进行cDNA合成，按试剂盒说明书进行操作，反应条件为：37℃、60 min，85℃、5 min，cDNA置于-20℃。

1.3.3 实时荧光定量PCR反应 qTOWER 3G 实时荧光定量PCR检测系统（德国Jena公司）进行扩增，引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下：GAPDHF：5’-CCTGGTATGACAACGAATTTG-3’；GAPDHR：5’-CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCC-3’；Linc00511-F：5’-TCCTCACAGGGGGTAGTAGG-3’；Linc00511-R：5’-CCCTTCTCCCTCGGTCATTT-3'。PCR反应条件：95℃、10 s，95℃变性5 s，60℃、20 s，40个循环。每个样品设置3个复孔，基因相对表达量采用2-ΔΔCt计算。

1.3.4 肿瘤标志物CYFRA检测 采用全自动电化学发光免疫分析仪测定肺癌和健康对照组血清样本中范围为0～3.3 U/mL。

1.4 观察指标

实时荧光定量PCR 检测血清Linc00511表达水平；受试者工作特征（ROC）曲线、曲线下面积（AUC）、危险分数分析评估Linc00511对肺癌的诊断效能；计算灵敏度、特异度、阳性预测值（positive predictive value, PPV）和阴性预测值（negative predictive value, NPV），探讨Linc00511独立及联合检测在肺癌诊断中的应用价值。

1.5 统计方法

细胞角蛋白片段（cytokeratin fragmen, CYFRA）表达量具体数据通过查阅临床病例资料获得，采用SPSS 23.0统计学软件进行数据，非正态分布的计量资料，以中位数（第25～75百分位数）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用非参数检验。GraphPad Prism 6进行图形绘制，并联法进行联合诊断。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Linc00511在肺癌血清中高表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，Linc00511在对照组血清中的相对表达量为0.787（0.397，1.643），在肺癌组血清中的相对表达量为1.933（1.315，3.229），明显高于前者，差异有统计学意义（Z=-5.939，P＜0.001）。见图1。

图1 肺癌病例与正常血清中Linc00511的表达

2.2 Linc00511的血清表达量与临床因素的关系

将肺癌组病例分别按照性别、年龄和是否远处转移情况进行分组，分析Linc00511的血清表达量的组间差异，结果显示其血清表达水平在男性（n=35）和女性（n=25）患者血清中的表达量分别为（2.183±1.519）和（2.987±2.014），差异无统计学意义（t=-1.764，P=0.083）；在年龄＜60岁（n=21）和≥60岁（n=39）岁肺癌患者血清中的表达量分别为（2.260±1.534）和（2.393±1.937），差异无统计学意义（t=0.482，P=0.631）；Linc00511在M0肺癌患者（n=49）血清中的表达量为2.177（1.422，3.570），M1肺癌患者（n=11）血清表达量为1.432（1.219，1.876），二者比较差异有统计学意义（Z=-2.226，P=0.026），见图2。

图2 Linc00511的血清表达量与临床因素的关系

2.3 Linc00511和CYFRA诊断肺癌的ROC曲线分析

将研究对象血清样本的CYFRA检测进行统计，结果显示：肺癌组患者CYFRA表达量为2.805（2.085，4.930），对照组CYFRA表达量为2.040（1.470，2.880），两组比较差异有统计学意义（Z=-4.119，P＜0.01），见图3A，ROC曲线提示：CYFRA诊断肺癌的曲线下面积（AUC）为0.704（95%CI：0.618～0.790），Linc00511诊断肺癌ROC曲线AUC为0.806（95%CI：0.735～0.877，P＜0.01）。将Linc00511与CYFRA联合检测用于诊断肺癌，ROC曲线AUC为0.859（95%CI：0.799～0.920，P＜0.01），见图3B。

图3 Linc00511与CYFRA检测肺癌ROC曲线分析

2.4 Linc00511和CYFRA诊断肺癌的效能分析

将Linc00511与肿瘤标志物CYFRA对肺癌的诊断效能进行比较，结果显示，Linc00511诊断肺癌的特异度低于CYFRA，但其诊断的敏感度和NPV高于CYFRA，而二者联合检测的敏感度、特异度、PPV、NPV均高于CYFRA单独检测，见表1。

表1 Linc00511、CYFRA单独及联合检测的临床诊断效能

3 讨论

我国是肺癌的高发病率国家，该病分别占男、女恶性肿瘤发病率的第1位和第2位，除影像学、病理学检查外，血清标志物检测是诊断该病重要的辅助检查，常见的血清标志物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖链抗原125（Carbohydrate antigen 125，CA125）、CYFRA等[5]，但目前尚未发现能够准确早期诊断该病的单一标志物[6-8]，联检模式可提高诊断的效果，探究有价值的生物学标志物对肿瘤靶向治疗具有重要意义。

众多新方法的涌现，使Lnc RNAs在癌症中的功能逐步被阐明[9-10]。Linc00511在多种肿瘤中表达失调，绝大多数文献支持Linc00511可能作为癌基因发挥作用的观点[11-13]，但Linc00511在恶性肿瘤中的生物学功能有待进一步研究。

目前，Linc00511在肺癌组织及相关细胞系中的表达研究较多，有关肺癌患者Linc00511血清学检测的研究国内未见报道，Chunlin Li等[14]的研究采用qPCR检测非小细胞肺癌患者（62例）和对照组（62例）血清Linc00511的表达水平，并对其分析比较，结果提示肺癌患者中Linc00511的表达明显高于健康对照组（P＜0.05），本研究分析60例肺癌组与79名健康对照组血清Linc00511的表达量，结果同样提示肺癌组Linc00511表达高于对照组（P＜0.05），该结论与前述研究结论具有良好的一致性，此外，本研究还提示受试者血清Linc00511的表达不受性别、年龄因素影响，但与患者转移情况有关（P＜0.05），因此，Linc00511有可能作为肺癌的诊断乃至预后评估的指标。

CYFRA是目前临床上常用的诊断肺癌的血清学指标之一[15]，本研究通过查阅病历资料，绘制Linc00511与CYFRA诊断肺癌的ROC曲线并进一步分析二者单独诊断和联合诊断效能，结果提示，二者联合检测灵敏度和特异度分别为53.3%和88.6%，高于CYFRA单独检测的41.7%和82.3%；PPV和NPV分别为78.0%和71.4%，高于CYFRA单独检测的64.1%和65.0%，即Linc00511与CYFRA联合检测诊断效能高于CYFRA单独检测。因此Linc00511在肺癌的诊断中可能具有一定的临床应用价值。

综上所述，本研究通过检测Linc00511在肺癌患者血清中的表达水平，分析其与肺癌临床病理特征的关系，探讨其单独检测及与CYFRA联合检测在肺癌诊断中的临床价值，为肺癌的分子诊断提供实验依据。但是，研究对Linc00511在肺癌诊断中的临床价值只是做了粗浅探讨，研究样本数量十分有限，对Linc00511与肺癌其他病理学特征（如家族史、吸烟史、肿瘤分化程度、病理分期等）的相关性并未进行深入分析，Linc00511在肺癌中发挥作用的分子机制研究部分也尚未深入探讨，这些还需进行更深入、系统的后续实验研究来证实。