长期有氧运动通过上调CTRP9-AdipoR1-AMPKeNOS信号通路改善自发性高血压大鼠心肌功能

张昆茹，杜 丽，胡 萌

目前，全球成人高血压患者已增至约12.8 亿（Greenhalgh et al.，2021）。高血压状态下动脉血压升高，心肌超负荷工作，心肌结构及功能发生变化，如不及时进行干预，将会引起心律失常、心衰及心肌梗死等并发症，甚至危及生命。高血压性心脏病已成为当今中国十大致死疾病之一（Zhang et al.， 2019）。探索改善高血压状态下的心肌功能和降低高血压性心脏病的发病率及死亡率的有效方法是一项紧迫且艰巨的任务。

近年来，研究发现一个与脂联素（adiponectin，APN）高度同源的蛋白超家族C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白（C1q/TNF-related proteins，CTRPs）家族。其中，CTRP9 与APN 的同源性最高，在血清、脂肪和心肌组织中高表达。CTRP9 不仅可以调节代谢、改善胰岛素敏感性，且对心脏和血管具有广泛的保护作用（雷虹 等， 2015； Yang et al.，2016）。CTRP9 可通过改善内皮依赖性舒张功能（杨瑞等， 2016）、抗氧化、抗血凝等作用保护血管内皮；CTRP9 还可通过抗炎、调节内皮细胞功能及代谢紊乱等途径减缓冠心病（coronary artery disease，CAD）的进程（Zhang et al.，2020）。Fujita 等（2017）研究认为，血浆中CTRP9 水平可以作为糖尿病肾脏血管损伤的生物学标志（姚希 等，2020）。低水平血清CTRP9 不但与冠心病具有相关性（张正伟 等，2016），而且增加了心衰的发病率及死亡率（Gao et al.，2019）。

CTRP9 主要通过CTRP9-AdipoR1-AMPK 信号途径发挥其心血管保护作用。CTRP9 激活该途径可改善高脂饮食大鼠血管内皮依赖性舒张功能（Zheng et al.， 2011），减轻血管内皮细胞损伤（Sun et al.， 2017），CTRP9 诱导的低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉血管的舒张作用（杨瑞 等，2016）、CTRP9 减轻血管的炎症反应均与AMPK 活化有关（Jung et al.， 2016）。对心肌而言，CTRP9 可通过激活AMPK-eNOS 信号通路抑制心肌细胞的凋亡、保护缺血/再灌注心肌（Kambara et al.， 2012）。心肌CTRP9 的表达降低与糖尿病性缺血心肌损伤有关（Su et al.， 2013）。然而，在实验性压力负荷增加的条件下，CTRP9 在心肌的表达增加与病理性的心肌肥大、心肌纤维化及心肌功能紊乱有关（Appari et al.， 2017）。而自发性高血压状态下，CTRP9 与心肌功能之间的关系尚不清楚。

体力活动减少是心血管疾病的主要危险因子之一（姜迪 等， 2014），运动训练不仅可以降低心血管疾病的危险因子，还可改善心肌功能。内源性心肌保护因子的分泌增加是运动发挥心肌保护作用的机制之一（Guo et al.，2020）。研究显示，健康个体一次高强度的间歇运动就可以增加血清中CTRP9 的水平（Kon et al.， 2019）。高血压状态下，运动对血清及心肌CTRP9 的表达有何影响、其在运动改善高血压心肌功能中的作用并不明确。据此，本研究旨在通过建立长期游泳运动模型，明确CTRP9 在运动改善自发性高血压大鼠心肌功能中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

18 只4 周龄雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠和20 只自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat， SHR）购于北京维通利华有限公司。WKY 大鼠随机分为WKY 安静组（WKY 组，n=9）和WKY 运动组（WE 组，n=9），SHR大鼠随机分为SHR 安静组（SHR 组，n=9）和SHR 运动组（SE 组，n=11）。

1.2 运动方案

运动组大鼠进行9 周的无负重游泳运动。第1 周时，第1 天游泳15 min，以后每天递增15 min，直至游泳时间递增至60 min。随后每周运动6 天，每天进行1 次60 min的游泳运动，持续8 周。最后1 次运动结束后24 h 进行检测，心动超声检测心功能的变化，透射电镜观察大鼠心肌细 胞 的 结 构，Western blot 检 测 心 肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 的蛋白表达水平的变化，Elisa 试剂盒检测血清中CTRP9 和心肌NO 的浓度。

1.3 心动超声检查

用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于板上，采用 ⅤINNO 6ⅤET 小动物超声仪进行心脏超声检查。大鼠胸前脱毛后涂抹超声耦合剂，超声探头置于胸骨左侧，与胸骨中线成10°～30°，显示胸骨左室长轴切面。在左室短轴切面，于左心室乳头肌短轴切面使用解剖M 型超声，取样线穿过前间隔和后侧壁。由二维图像引导，取M 型曲线记录左心室运动曲线并进行测量，测量左心室射血分数（ejection fraction，EF）、左心室短轴缩短率（fractional shortening，FS）、左心室舒张末期内径（left ventricular internal diastolic dimension，LⅤIDd）和左心室收缩末期内径（left ventricular internal dimension systole，LⅤIDs），以期评价心肌功能。

1.4 透射电镜切片制备

取心肌组织，立即放入4%戊二醛中，5 min 后修块并进行定向切割，将样品剪切成1 mm×1 mm×2 mm 小块，再放入4%戊二醛中固定1～2 h，后用1%锇酸后固定0.5～1.0 h；样品经丙酮系列脱水后，环氧树脂包埋；超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅进行双染色后，采用日立HT 7700 型透射电镜观察。

1.5 Western blotting检测

取大鼠心肌组织提取蛋白，BCA 法测蛋白浓度，根据蛋白定量结果调整上样量。蛋白经SDS-PAGE 凝胶电泳分离后转移到PⅤDF 膜上，滴加50 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST 洗膜后依次加入1∶1 000 兔抗大鼠CTRP9（Abcam）、AdipoR1（Abcam）、AMPK（Abcam）、eNOS 抗体（Abcam）4 ℃孵育过夜。次日洗膜后，加入1∶1 000 的HRP 标记的羊抗兔IgG 室温孵育1 h。免疫印迹化学发光法检测，AZURE C300 凝胶成像系统进行半定量分析。

1.6 ELISA检测

腹主动脉取血，离心提取血清组织，CTRP9 试剂盒（Abcam）检测血清CTRP9 的浓度。严格按照CTRP9 试剂盒说明书操作。

取大鼠心肌组织提取蛋白，NO 试剂盒（Abcam）检测心肌NO 的浓度。严格按照NO 试剂盒说明书操作。

1.7 数据处理

实验数据均以M±SD表示，采用GraphPad Prism 6.0统计程序进行统计学分析。多组间数据比较采用ANOⅤA方差分析，若总体差异显著，再以post-hoc 事后检验分析相应2 组间显著性差别。以P＜0.05 为具有显著性差异，P＜0.01 为具有极显著性差异。

2 结果

2.1 运动对自发性高血压大鼠心肌超微结构的影响

透射电镜检测结果显示，与WKY 组相比，SHR 组大鼠心肌肌原纤维排列紊乱，肌小节结构破坏，Z 线断裂，部分区域的肌丝溶解消失，线粒体形态异常，排布无规律，细胞核不完整；与SHR 组相比，SE 组大鼠心肌肌节明暗带比较清晰，线粒体多数排列有序、紧凑，细胞核较完整，细胞的超微结构明显改善（图1）。本研究表明，SHR 组大鼠心肌纤维超微结构受损，运动对其有改善作用。

图1 各组大鼠心肌超微结构比较（2 000×）Figure 1. Comparison of Myocardial Ultrastructure of Rats in Each Group （2 000×）

2.2 运动对自发性高血压大鼠心肌功能的影响

心脏超声结果显示（图2），与WKY 组比较，WE 组大鼠的EF、FS 及LⅤIDd 均升高，且具有显著性差异（91.51±1.22 vs 85.50±1.09，P＜0.05；62.36±1.40 vs 52.68±2.07，P＜0.05；5.02±0.19 vs 3.73±0.09，P＜0.01）；SHR 组大鼠LⅤIDs明显增加（2.17±0.03 vs 1.77±0.09，P＜0.05），EF、FS 均明显下 降（78.97±1.03 vs 85.50±1.09，P＜0.05；42.75±1.12 vs 52.68±2.07，P＜0.05），说明自发性高血压大鼠心肌功能下降。与SHR 组大鼠相比，SE 组大鼠的心肌功能有所改善，表现为EF、FS、LⅤIDd 均有明显上升（87.53±0.95 vs 78.97±1.03，P＜0.01；51.24±1.23 vs 42.75±1.12，P＜0.01；4.80±0.06 vs 3.67±0.15，P＜0.01）。本研究结果表明，有氧运动可明显改善WKY 和SHR 大鼠的心肌功能。

图2 各组大鼠心动超声结果比较Figure 2. Comparison of Echocardiography of Rats in Each Group

2.3 运动对自发性高血压大鼠血清CTRP9水平的影响

同WKY 组相比，WE 组大鼠血清CTRP9 蛋白表达水平明显增高（3.14±0.08 vs 2.83±0.10，P＜0.05；图3），SHR组大鼠CTRP9 表达水平明显降低（2.56±0.06 vs 2.83±0.10，P＜0.05；图3）。同SHR 组相比，SE 组大鼠血清中CTRP9 蛋白水平明显增加，且有极显著性差异（3.15±0.08 vs 2.56±0.06，P＜0.01；图3）。本研究结果表明，运动可以增加自发性高血压大鼠血清中CTRP9的水平。

图3 各组大鼠血清CTRP9的水平比较Figure 3. Comparison of CTRP9 Concentration in Serum of Rats in Each Group

2.4 运动对自发性高血压大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK及eNOS表达的影响

与WKY 组相比，WE 组大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 蛋白表达均升高，且有显著性差异（1.26±0.03 vs 1.18±0.03，P＜0.05；0.89±0.04 vs 0.83±0.03，P＜0.05；0.96±0.02 vs 0.89±0.03，P＜0.05；1.21±0.02 vs 1.13±0.02，P＜0.01；图4）；SHR 组大鼠心肌4 种蛋白表达均呈明显下降趋势，且有显著差异（1.18±0.03 vs 1.06±0.04，P＜0.05；0.78±0.05 vs 0.83±0.03，P＜0.05；0.76±0.04 vs 0.89±0.03，P＜0.01；1.07±0.01 vs 1.13±0.02，P＜0.05；图4）。与SHR 组相比，SE 组大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 蛋白表达均明显增加，且有显著性差异（1.12±0.03 vs 1.06±0.04，P＜0.05；0.90±0.06 vs 0.78±0.05，P＜0.01；0.92±0.02 vs 0.76±0.04，P＜0.01；1.16±0.03 vs 1.07±0.01，P＜0.05；图4）。本研究结果表明，有氧运动可明显增加自发性高血压大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 的表达水平，上调心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信号系统。

图4 各组大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS蛋白表达比较Figure 4. Comparison of Protein Expression of CTRP9， AdipoR1， AMPK， and eNOS in Myocardium of Rats in Each Group

2.5 运动对自发性高血压大鼠心肌NO浓度的影响

为了进一步探讨运动对自发性高血压大鼠CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信号系统的影响，对该信号系统的下游底物NO 浓度进行检测（图5）。实验结果显示，与WKY 组相比，WE 组大鼠心肌NO 浓度明显增高，且有极显著性差异（35.18±0.82 vs 32.11±0.44，P＜0.01）；SHR组大鼠心肌NO 水平明显降低，且有显著性差异（30.09±0.55 vs 32.11±0.44，P＜0.05）。同SHR 组相比，SE 组大鼠心肌NO 浓度明显增高，有极显著性差异（34.24±0.98 vs 30.09±0.55，P＜0.01）。本研究结果显示，运动可以增加自发性高血压大鼠心肌NO 的浓度，与运动对心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 的表达影响一致，说明运动可以上调自发性高血压大鼠心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS信号系统，促进NO 释放，从而发挥对心肌的保护作用。

图5 各组大鼠心肌NO浓度比较Figure 5. Comparison of NO Concentration in Myocardium of Rats in Each Group

3 讨论

CTRP9 是一个具有广泛心血管保护作用的细胞因子，在心肌和血清中高表达。血清CTRP9 水平降低可作为糖尿病、冠心病、冠心病合并糖尿病等疾病的独立危险因素（杨和运 等，2020）。原发性高血压随着分级的提升，血清CTRP9 水平随之降低（郭靓 等，2019；李丽贤 等，2019）。血清CTRP9 浓度降低与心衰的发病率及死亡率增高有关（Gao et al.，2019）。2 型糖尿病患者、2 型糖尿病合并动脉粥样硬化患者血清CTRP9 的水平均降低，而且动脉的顺应性较差（Asada et al.， 2016； Jung et al.， 2014）。高脂饮食大鼠同样存在血清CTRP9 水平降低的现象。去除CTRP9 基因的小鼠在老年表现为肥胖合并胰岛素抵抗，而CTRP9 转基因小鼠饮食诱导的肥胖及代谢紊乱症状得到改善（Peterson et al.， 2013）。血清CTRP9 水平的降低与心血管的损伤及功能紊乱有关，CTRP9 水平增加可以改善代谢紊乱及胰岛素抵抗，改善心血管功能。本研究发现，与WKY 组相比，SHR 组大鼠的心肌超微结构破坏，心肌功能紊乱，血清CTRP9 水平降低；与SHR 组相比，SE 组大鼠心肌细胞的超微结构和心肌功能明显改善，血清CTRP9 水平增加。据此，本研究推测，SHR 大鼠血清CTRP9 水平的降低可能与心肌结构受损和心肌功能紊乱有关，运动对SHR 大鼠心肌结构和功能的改善作用可能与血清CTRP9 水平上调有关。

本研究显示，8周的有氧运动可明显增加SHR大鼠血清及心肌CTRP9这一内源性心肌保护因子的水平。本研究推测，血清中CTRP9 的增加可能与运动引起的心肌CTRP9 的增加有关。Kon 等（2019）研究发现，一次大强度的间歇运动可增加健康个体血清中CTRP9 的水平，改善胰岛素的敏感性，这与本研究结果一致。Choi 等（2013）研究显示，3 个月的有氧及阻力训练可以增加血浆中CTRP5 的水平，说明运动对血清中CTRP 家族分子的影响与运动方案有关。

CTRP9 可通过激活AdipoR1-AMPK 信号途径发挥对心血管的保护作用。本研究中，自发性高血压大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK 的蛋白表达明显下降，CTRP9-AdipoR1-AMPK 信号系统下调，CTRP9 对心肌的保护作用减弱，心肌功能下降；而经过8 周有氧运动后，自发性高血压大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK 的表达明显提高，CTRP9-AdipoR1-AMPK 信号系统上调，CTRP9 的心肌保护作用增加，心肌功能明显改善。本研究结果表明，运动对自发性高血压大鼠的心肌保护作用与心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK 信号系统的上调有关。

eNOS 作为CTRP9-AdipoR1-AMPK 信号途径的下游底物之一被激活后，促使NO 的生成，发挥对心血管的保护作用。本研究发现，自发性高血压大鼠心肌eNOS 和NO 的水平明显下降，而运动可显著提高心肌eNOS 和NO的水平。本研究结果表明，运动可能通过激活CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 通路增加NO 的水平，发挥对心肌的保护作用。此外，CTRP9 还可激活AdipoR1-AMPKNFκB 途径，增强免疫功能、减轻心梗大鼠心肌损伤（Liu et al.， 2019），而CTRP9 抗动脉粥样硬化的作用与CTRP9激活AdipoR1-AMPK 途径抑制mTOR 的磷酸化有关（Huang et al.， 2019）。下游底物NFκB、mTOR 与CTRP9 对高血压大鼠心肌的保护作用是否有关及其确切机制，还有待深入探究。

4 结论

1）自发性高血压大鼠心肌结构受损及心肌功能下降与心肌CTRP9 水平下降有关。

2）长期有氧运动可通过促进心肌CTRP9 的表达，上调CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信号通路改善自发性高血压大鼠的心肌功能。