食管癌细胞中脂多糖对肿瘤坏死因子α诱导程序性细胞死亡配体1表达的影响

胡慧玲，李惠武，朱世茂，杨银银，海妮萨依姆·图尔荪，王永晨，李卉

作者单位：1新疆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 830011；

2粤北人民医院医学研究中心，广东 韶关 512025；

3新疆医科大学中心实验室，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐830011

食管癌（esophageal cancer，EC）是常见的恶性肿瘤，在全球肿瘤的发病率与死亡率中分别居第七位与第六位［1］。中国是食管癌高发国家，食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是其主要类型，近年来，食管癌的诊断与治疗虽然取得了较大进展，但预后较差，有效治疗药物较少，5 年相对生存率和观察生存率仅为20.9% 和18.4%［2］。因此研究食管癌的发病机制对其治疗及预后有着重大意义。

基于肿瘤学和免疫学的创新与发展，研究［3］发现机体的免疫逃逸与肿瘤的形成密切相关。免疫逃逸是肿瘤存活和发展的关键因素，是指肿瘤细胞在增殖和转移过程中可以通过各种机制逃避免疫系统的识别和攻击。利用免疫疗法阻断肿瘤的免疫逃逸，恢复机体识别杀伤肿瘤细胞的能力是目前的研究热点，主要为程序性细胞死亡受体1（pro⁃grammed cell death protein 1，PD-1）/程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand1，PD-L1）拮抗剂［4］。导致肿瘤生长和转移的关键是肿瘤免疫抑制微环境，肿瘤细胞过表达PD-L1，通过与活化的T 淋巴细胞表面PD-1 受体特异性结合，抑制免疫反应，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视和杀伤，导致免疫逃逸。在正常的生理条件下通过PD-L1/PD-1 轴抑制免疫反应有助于维持耐受性和自身免疫之间的平衡。因此，PD-L1 是维持免疫稳态的关键［5-6］。研究发现，由巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor- alpha， TNF-α）能诱导PD-L1 的表达。在小鼠模型中，PD-L1 的表达在单核细胞成熟为巨噬细胞的过程中明显增加，并在单核细胞分化为巨噬细胞时达到其峰值［7］。PD-L1 的表达在系统性红斑狼疮病人的单核细胞中缺乏，但可以通过外源性添加TNF-α 来重建［8］。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）具有活化巨噬细胞和中性粒细胞、T 淋巴细胞等作用，产生一系列炎症反应。肿瘤微环境在癌症转移中起着至关重要的作用，并显著影响癌症病人的治疗效果［9］。近年来，大量的研究显示Jak2/Stat3信号通路的持续激活与肿瘤的发生发展密不可分［10］。

本研究自2020 年5―10 月通过使用LPS 经Jak2/Stat3 信号通路干预TNF-α 诱导的PD-L1，验证LPS 对PD-L1 的干预作用，为食管癌的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料人食管鳞癌Eca-109细胞株购自于中国科学院上海细胞库。Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司；化学发光底物试剂盒（ECL）购自安徽Biosharp 公司；BSA 蛋白检测试剂盒、彩虹蛋白marker均购自美国Thermo公司；RPMI-1640 培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、青链霉素混合液、磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液均购自以色列Biological Industries 公司；抗体：p-Jak2、p-Stat3、PD-L1、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 均购自美国Cell Signaling Technology 公司；β 肌动蛋白（β-ac⁃tin）购自北京中杉金桥公司；TNF-α细胞诱导因子购自美国Pepro Tech 公司；LPS 脂多糖购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将人食管癌细胞株Eca-109 培养于含1%青链霉素混合液及10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，置于湿度饱和、5%二氧化碳、37 ℃的培养箱中。待细胞汇合度为80%~90%时，按比例进行细胞传代。取生长状态稳定的细胞以每孔2×106个接种于六孔板中，待细胞贴壁后PBS洗涤并用含1%青链霉素混合液及5%胎牛血清的RPMI-1640 培养基换液。将实验分为空白对照组、TNF-α诱导组、TNF-α+LPS 干预组，培养24 h 后收集细胞，用于后续实验。

1.2.2 蛋白质印迹法收集已处理的各组细胞，提取总蛋白。使用BCA 法检测蛋白质浓度，取等量蛋白以10%SDS-PAGE 进行电泳使蛋白分离，湿转法转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h，孵育单克隆抗体4 ℃过夜，等渗缓冲盐溶液（TBST）洗涤后孵育二抗1 h，TBST 再次洗涤，ECL 显色后凝胶成像设备采集图像。

1.2.3 细胞凋亡实验胰酶消化收集24 h 细胞，使用PBS 制成单细胞悬液，调整细胞数为1×106个，参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，每组实验重复3次。

1.3 统计学方法实验数据使用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 对Eca-109 细胞中不同时间点p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白表达量的影响使用浓度为100µg/L 的LPS 对Eca-109 细胞进行干预，并在干预15 min 后加入浓度为20 µg/L 的TNF-α 诱导1.5、3、6、12、24 h，收集细胞提取蛋白，应用蛋白质印迹法检测细胞内p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白的表达水平。结果显示，与对照组比，经TNF-α 诱导后细胞内p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表达量在24 h明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），提示TNF-α 在诱导PDL1 表达升高的同时激活了Jak2/Stat3 信号通路。与TNF-α 诱导组相比，TNF-α+LPS 干预组的p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表达量在24 h降低，差异有统计学意义（P<0.05），说明LPS 能通过干预Jak2/Stat3 信号通路下调PD-L1的蛋白表达，如表1，图1所示。

图1 脂多糖（LPS）干预后肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导Eca-109细胞p-Jak2、p-Stat3、序性细胞死亡配体1（PD-L1）蛋白表达水平变化

表1 LPS干预后TNF-α诱导Eca-109细胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表达水平变化/

表1 LPS干预后TNF-α诱导Eca-109细胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表达水平变化/

注：TNF-α 为肿瘤坏死因子α，LPS 为脂多糖，PD-L1为程序性细胞死亡配体1。①与对照组相比，均P<0.05。②与TNF-α组相比，均P<0.05。

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2.2 不同浓度LPS 干预对Eca-109 细胞中p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 蛋白表达量的影响使用浓度为100、200、400、800 µg/L 的LPS 对Eca-109 细胞进行干预，并在干预15 min 后加入浓度为20 µg/L 的TNF-α 诱导24 h，收集细胞提取蛋白进行检测。结果显示，与对照组相比，经TNF-α诱导后PD-L1蛋白表达量明显升高，同时p-Jak2、p-Stat3的表达量也升高，差异有统计学意义（P<0.05），提示在食管鳞癌Eca-109 细胞中Jak2/Stat3 信号通路是TNF-α 诱导PD-L1 升高的主要细胞内信号传导通路。与TNF-α诱导组相比，使用浓度为100、200、400、800 µg/L 的LPS 经TNF-α 诱导后进行干预，细胞内p-Jak2、p-Stat3、PD-L1的蛋白表达量均降低，差异有统计学意义（P<0.05），且呈浓度依赖性。如表2，图2所示。

图2 不同浓度脂多糖（LPS）干预后肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导Eca-109细胞p-Jak2、p-Stat3、序性细胞死亡配体1（PD-L1）蛋白表达水平变化

表2 不同浓度LPS干预后TNF-α诱导Eca-109细胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表达水平变化/

表2 不同浓度LPS干预后TNF-α诱导Eca-109细胞p-Jak2、p-Stat3、PD-L1蛋白表达水平变化/

注：TNF-α 为肿瘤坏死因子α，LPS 为脂多糖，PD-L1为程序性细胞死亡配体1。①与对照组相比，均P<0.05。②与TNF-α组相比，均P<0.05。

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2.3 LPS干预后对Eca-109细胞凋亡的影响使用浓度为100 µg/L的LPS对Eca-109细胞进行干预，并在干预15 min 后加入浓度为20 µg/L 的TNF-α 诱导24 h，收集细胞悬液，用流式细胞仪上机检测。结果显示，与对照组（4.77±0.15）%相比，LPS 干预组（8.20±1.65）%细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P<0.05），TNF-α+LPS 干预组（7.63±1.37）%较对照组相比，细胞凋亡率也相应增加，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

食管癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，由于早期症状不明显，一般发现时到了中晚期，有效治疗手段较少，预后差，故病死率高［11］。因此，寻找新的治疗方法来提高食管癌病人的生存率尤为重要，免疫治疗的问世，提供了研究思路。

免疫逃逸是肿瘤发生发展的重要因素，PD-L1在多种恶性肿瘤细胞中的高表达是常见的免疫逃逸策略，并提示肿瘤治疗的预后不良［12］。本研究采用TNF-α 诱导Eca-109细胞24 h，成功建立PD-L1高表达模型，评价LPS 对TNF-α 诱导PD-L1 表达的影响。实验结果表明LPS 干预能够显著降低PD-L1 的蛋白表达，降低p-Jak2、p-Stat3 的蛋白表达水平，同时能促进Eca-109 细胞的凋亡，提示LPS 可能通过Jak2/Stat3 信号通路下调PD-L1 的表达，由此调节肿瘤的免疫逃逸。

近年来，针对靶向PD-1/PD-L1 的免疫检查点抑制剂对食管癌显示出较好的疗效，部分药物如纳武单抗（nivolumab）已被美国国家综合癌症网络（NCCN）指南纳入晚期ESCC 二线治疗的标准选择之一，卡瑞利珠单抗被2020 年中国临床肿瘤学会（CSCO）指南纳入晚期食管癌二线治疗的Ⅰ级专家推荐［13-14］。目前，虽然PD-1/PD-L1 抑制剂在多项临床试验中表现出较好的疗效且有部分药物已上市，但其临床应用仍存在相应的局限性，探究其具体作用机制仍需要大量的科研工作。据相关报道［15］，实体瘤可以通过促进肿瘤微环境中的TNF-α 诱导PDL1 的蛋白表达升高，从而抑制机体的正常免疫应答，导致免疫逃逸。研究［16］发现，TNF-α能诱导人结肠癌HCT116 细胞系和人前列腺癌LNCaP 细胞系中PD-L1 mRNA 的表达。另外Donia 等［17］研究发现TNF-α 能促进PD-L1 在黑色素瘤细胞中高表达，从而导致免疫逃逸。本研究采用TNF-α 刺激Eca-109细胞，PD-L1蛋白表达增加，说明模型建立成功。文献研究［18］报道，TNF-α 能诱导并激活脑周细胞中Jak2/Stat3 信号通路从而导致脑部炎症。另有研究［19］报道，TNF-α 在肠上皮Caco-2 细胞中的表达与释放可能通过激活Jak2/Stat3 信号通路导致炎症性肠病。Jak2/Stat3 信号通路的持续激活与肿瘤的发生发展密切相关，活化后的Jak2/Stat3信号通路能调控下游基因PD-L1 的表达，进而促进肿瘤细胞的增殖与转移，抑制其凋亡，导致肿瘤的发生发展［20］。本研究结果显示，Eca-109细胞经TNF-α刺激后高表达PD-L1，同时p-Jak2、p-Stat3 的蛋白表达水平升高，激活Jak2/Stat3 信号通路，说明在食管鳞癌Eca-109 细胞中Jak2/Stat3 信号通路是TNF-α 诱导PD-L1高表达的主要细胞内信号传导通路，加入LPS 干预后，p-Jak2、p-Stat3、PD-L1 的表达水平下降，说明LPS 能抑制Jak2/Stat3 信号通路的转导，下调PD-L1的表达，从而抑制食管鳞癌Eca-109 细胞的增殖并诱导其凋亡。提示LPS 可能通过阻断Jak2/Stat3 信号通路来发挥抗肿瘤效应。

综上所述，LPS 可能通过Jak2/Stat3 信号通路降低PD-L1的表达，从而诱导食管鳞癌Eca-109细胞的凋亡来发挥抗肿瘤作用，本研究为食管癌的靶向治疗提供了新思路。