高效液相色谱法同时测定液体酸化剂中的有机酸含量

真 诚 谭 薇 赵梅仙 贾红敏

（中牧实业股份有限公司，北京 100095）

酸化剂是目前市场上一种重要的替抗化合物，主要有固体和液体两大类[1-2]。液体酸化剂主要应用于家禽、仔猪和反刍动物中。在规模化养殖场的封闭饮水线中存在大量的有害微生物，会影响畜禽健康生长[3]。在养殖过程中添加液体酸化剂[4]，可有效抑菌杀菌，提高机体抗应激、抗病能力，减少疾病发生[5-8]；改善水质，降低pH值，清理管道壁生物膜，降低饮水微生物传播风险[9-12]；可促进有益菌生长，提高消化酶活性，改善肠道健康，达到促生长和提高饲料利用率的作用[13-15]。液体酸化剂产品在动物生产中的使用量和实际应用效果主要取决于产品中有机酸的种类和含量，所以产品在研发与生产过程中有必要通过精准检测进行产品含量分析及质控。

目前，有机酸检测的方法有高效液相色谱法[16-17]、气质联用法[18]、气相色谱法[19-20]、离子色谱法[21]等。气质联用法和气相色谱法虽具有较强的专属性，但适用范围小，仅能够检测低沸点有机酸含量，且检测成本较高。离子色谱法多使用稀强酸，对设备具有一定不可逆的腐蚀作用，而且检测时间较长，综合检测效率较低。高效液相色谱法是目前检测有机酸含量的常用方法，此法特异性强、精确度高，可用于大多数有机酸的同时分离检测。现阶段市场上的液体酸化剂产品主要以甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中的1 种或几种为主要成分，还未见有对这4种有机酸同时检测的报道。本研究根据液体酸化剂产品的特点，在大量试验基础上进行色谱条件优化，为液体酸化剂的研发及生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器设备与试剂

主要仪器：1260 型高效液相色谱分析仪（美国Agilent 公司）、Atlantis T3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Waters 公司）、UV-2100 型紫外可见分光光度仪（日本Shimadzu 公司）、MC204 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、FE20型pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）、KD-600DV型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

主要试剂：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸（分析标准品，浓度＞99%，麦克林公司）；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；磷酸二氢钾（分析纯，西陇科学股份有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）；试验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 标准储备液制备

分别准确称取0.400 0 g（精确至0.000 1 g）甲酸、

0.400 0 g乙酸、0.200 0 g丙酸、0.200 0 g丁酸标准品，使用流动相B 溶解超声20 min，冷却，于100 mL 容量瓶中定容，制备质量浓度分别为40、40、20、20 g/L 的有机酸标准储备液，4 ℃保存，上机前用0.45 μm滤膜过滤。

1.2.2 样品处理

准确称取1 g 液体酸化剂产品于100 mL 容量瓶中，用流动相B稀释，超声20 min，冷却，定容，0.45 μm滤膜过滤，于样品瓶中待测。

1.2.3 色谱条件

使用Atlantis T3 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为30 ℃，乙腈为流动相A，20 mmol/L KH2PO4缓冲盐溶液（pH值2.9）为流动相B，流速为1 mL/min，检测波长220 nm，进样量20 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

分别测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸4 种有机酸的紫外吸收谱图，结果表明，4 种有机酸在220 nm 条件下均具有较大吸收，因此最终确定检测波长为220 nm。

2.1.2 缓冲盐浓度和pH值的选择

缓冲盐选择常用的磷酸盐，pH 值调整为小于4 种有机酸的酸度系数值，保证4 种有机酸以分子状态存在。但pH值不能过低，过低会导致峰形拖尾严重，保留效果不好，所以最终选择pH值为2.9。缓冲盐水平筛选了10、20、30 mmol/L。结果发现，20 mmol/L 的磷酸盐缓冲液可以满足4种有机酸均有合适的分离度。

2.1.3 色谱柱及洗脱浓度的选择

采用美国Agilent 公司1260 型高效液相色谱分析仪，比较了普通C18柱和Atlantis T3柱对4种有机酸的分离效果。由于4种有机酸中甲酸极性很大，在普通的C18色谱柱中无保留，因此选择Waters 公司更耐水的Atlantis T3色谱柱，使用100%流动相B 进行等度洗脱，等度洗脱（流动相A∶流动相B=0∶100）时，4种有机酸的色谱图见图1。

图1 等度洗脱为流动相A∶流动相B=0∶100时4种有机酸的色谱图

由图1 可知，甲酸有合适的保留因子，但是乙酸、丙酸、丁酸出峰时间过长，而且峰形存在拖尾现象。因此，考虑改用90%流动相B进行等度洗脱。

等度洗脱（流动相A∶流动相B=10∶90）时，4 种有机酸的色谱图见图2。由图2 可知，虽然乙酸、丙酸、丁酸分离效果较好，但甲酸与空白溶剂杂峰出峰重叠。空白溶剂的色谱图见图3。

图2 等度洗脱为流动相A∶流动相B=10∶90时4种有机酸的色谱图

图3 空白溶剂的色谱图

因此综合考虑，设置梯度洗脱，先使用100%的流动相B 进行洗脱，在甲酸出峰后调节流动相B 的比例，通过筛选，在15 min时将流动相B调整到20%，洗脱乙酸、丙酸和丁酸，最终同时检测4种有机酸的效果良好。

2.1.4 流速与柱温的选择

本试验分别比较了0.7、1.0、1.5 mL/min 3 种流速及20、30、40 ℃ 3 种柱温条件下的检测效果。结果表明，流速在0.7 mL/min时，出峰时间过长，降低了检测效率；流速为1.5 mL/min 时，甲酸出峰时间过早，与空白溶剂杂峰部分交汇不能有效分离；流速为1.0 mL/min 时，分析时间短，峰形分离效果好。柱温为40 ℃时，4 种有机酸的色谱图见图4。

图4 柱温为40 ℃时，4种有机酸的色谱图

由图4 可知，温度过高空白溶剂中的杂质峰出峰时间后移，使丙酸与空白溶剂杂峰出峰重叠。而选用柱温为30 ℃时，4 种有机酸都可有效分离，且峰形对称性良好。

2.1.5 提取条件的选择

有机酸均是弱酸，在水系流动相中易发生解离，不被非极性键合相保留，所以常用磷酸氢盐溶液溶解样品，可抑制溶液解离。试验比较了使用甲醇∶水=1∶1为提取条件和流动相B 为提取条件时的检测效果，结果表明，使用流动相B溶解样品可有效保留和分离4种有机酸。

2.2 有机酸标准曲线及方法检出限、定量限

按选定的色谱条件对4种有机酸标准品单独进样，确定各有机酸的分离时间。考虑一般液体酸化剂产品中有机酸的含量，将标准储备液稀释成浓度为0.5～8.0 g/L的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸标准工作液，进行上机检测，绘制甲酸、乙酸、丙酸、丁酸标准溶液色谱图，见图5。

图5 甲酸、乙酸、丙酸、丁酸标准溶液色谱图

将储备液进行大倍数稀释后上机测定，以3 倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限，测定仪器所能检出和定量的最低浓度。4种有机酸的保留时间、线性回归方程、相关系数、检出限及定量限见表2。由表2可知，4 种有机酸在0.5～8.0 g/L 线性范围内，相关系数为0.999 7～1.000 0，均呈现出良好的线性关系。4 种有机酸检出限在0.26～0.53 mg/L，定量限为0.70～2.65 mg/L，表明方法灵敏度较高。

表2 4种有机酸的保留时间、线性回归方程、相关系数、检出限及定量限

2.3 方法重复性

对同一液体酸化剂产品使用1.2.2方法处理，上机进行6 次检测，计算各有机酸含量的相对标准偏差值（RSD），液体酸化剂样品RSD值见表3。由表3可知，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的RSD 值分别为0.76%、1.41%、1.93%、0.84%，表明该方法精密度良好。

表3 液体酸化剂样品精密度检测结果 单位：%

2.4 加标回收率

准确称取6 个液体酸化剂产品，向其中加入不同浓度的有机酸混合标准液测定加标回收率，每种有机酸设置3个添加浓度，每个添加浓度进行2次平行测定，使用1.2.2 方法处理样品，并上机测定。液体酸化剂加标回收率的检测结果见表4。由表4 可知，4 种有机酸均可达到较稳定的回收率，回收率范围为94.1%～101.2%，表明方法有良好的准确度。

表4 液体酸化剂加标回收率的检测结果

2.5 样品测定

从市面上随机采购3种已知含量的液体酸化剂产品，按1.2.2 方法处理样品，对样品进行定性和定量检测。3种液体酸化剂产品的定量检测结果见表5。样品检测色谱图见图6。由表5 和图6 可知，本方法可以满足一般液体酸化剂中的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的测定需求。

图6 样品检测色谱图

表5 3种液体酸化剂产品的定量检测结果 单位：%

3 结论

本研究建立的高效液相色谱法可同时检测液体酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的含量。该方法分离效果和线性关系良好，精密度和准确度较高，样品前处理简单，检测时间短，可大幅提高检测效率。使用优化后的色谱方法对市场上已知含量的液体酸化剂样品进行检测，可准确检测不同种类液体酸化剂中有机酸的含量，能够满足液体酸化剂在研发和生产中的质控要求。