茶树纯露化学成分和抑菌活性研究

沈 丹

（河北化工医药职业技术学院药学与健康管理系，河北 石家庄 050000）

茶树纯露（tea tree hydrosol，TTH） 是桃金娘科（Myrtaceae）白千层属（MelaleucaL.）植物互叶白千层（Melaleucaalternifolia）的枝、叶在水蒸气蒸馏过程中分离出来的水相。TTH 是一种清澈无色的水溶液，具有肉豆蔻香气[1]。TTH植物的叶、枝经水蒸气蒸馏法提取出的精油名为茶树精油（tea tree oil，TTO）[2-4]，广泛应用于细菌和真菌感染引起的皮肤黏膜受损、口腔溃疡、牙龈炎等疾病[5-7]。

TTH 是茶树油生产过程中的副产物，具有茶树枝叶的水溶性物质，如鞣质、皂苷以及糖类，具有抑菌、抗病毒、免疫等药理活性[8-10]，具有广泛的应用前景。于晓雪等[11]发现，蛋鸡饲料中添加一定浓度的TTH 能够改善鸡蛋的蛋黄颜色、蛋白高度和哈夫单位等指标。李桂贤[12]研究表明，在断奶仔猪饲料中添加TTO 可以提高仔猪的生长性能。本文对TTH 进行化学成分富集，利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）对粗提物进行化学成分分析，并进行体外抑菌活性研究，以期为TTH 的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

TTH 购自北京科学城日化有限公司，牛肉膏、蛋白胨培养基购自天津市英博生化试剂有限公司，正己烷、乙醇、盐酸、氢氧化钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，D101 大孔吸附树脂、AB-8 大孔吸附树脂购自天津南开和成科技有限公司。

革兰氏阳性菌株：金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌；革兰氏阴性菌株：大肠埃希菌、副伤寒乙沙门菌、肺炎克雷伯菌；真菌：白色念珠菌。菌株均购自天津医科大学微生物实验室。

1.2 试验仪器

Agilent 6890/5973 气相-质谱联用仪、Agilent 7697A顶空自动进样器、SW-CJ-2FD双人单面净化工作台购自苏州净化设备有限公司，BL-50A压力灭菌锅购自上海博讯实业有限公司，AR2130 电子天平购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 化学成分富集

由于TTH 中的化学成分极性相对较小，所以本研究采用D101大孔吸附树脂和AB-8大孔吸附树脂对TTH中的化学成分进行富集。

对D101 大孔吸附树脂和AB-8 大孔吸附树脂进行树脂预处理。将5 kg 的D101 大孔吸附树脂和2 kg 的AB-8大孔吸附树脂分别在95%乙醇中浸泡12 h；将两种树脂分别装入合适的玻璃柱中；采用95%乙醇洗脱树脂，洗至流出液与水（1∶1）混合后无混浊现象；采用5%稀盐酸以4 BV/h的流速分别洗脱两种树脂2 h，蒸馏水洗至流出液的pH值为 7；5%氢氧化钠以4 BV/h的流速分别洗脱两种树脂2 h，蒸馏水洗至流出液的pH值为7。

将410 L 的TTH 以500 mL/h 的流速经过装有5 kg 的D101大孔吸附树脂柱（150 cm × 18 cm）富集TTH中的化学成分，所得流出液以400 mL/h 的流速经过装有2 kg的AB-8大孔吸附树脂柱（120 cm × 12 cm），对D101大孔吸附树脂柱未富集的化学成分进行二次富集。再用50%乙醇和95%乙醇两种洗脱剂洗脱两根树脂柱，得到M1-95%（35 g）、M1-50%（54 g）、M2-95%（2.5 g）和M2-50%（20 g）共4个部分，M1为经过D101大孔吸附树脂富集出的粗提物，M2 为经过D101 大孔吸附树脂富集后又经过AB-8 大孔吸附树脂再次富集得到的粗提物。

1.3.2 化学成分分析

采用GC-MS 对TTH 的2 个粗提物M1-95%和M2-95%进行化学成分分析。流速1.0 mL/min，进样量1 μL，分流进样，分流比为20∶1，进样口温度为250 ℃。升温程序：初始温度50 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min速率升至250 ℃，保持2 min。离子源温度：230 ℃。电离电压：70 eV。四级杆温度：150 ℃，保持5 min[13-14]。扫描模式为全扫描，扫描范围：50～650 m/z。采用GC-MS 分析和质谱库检索（NIST 和AMDIS）及文献对比，确定各个化学成分，运用峰面积归一化法，求得各成分的相对含量。

1.3.3 抑菌活性测定

将革兰氏阳性菌株（金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、化脓链球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌）、革兰氏阴性菌株（大肠埃希菌、副伤寒乙沙门菌、肺炎克雷伯菌）及真菌（白色念珠菌）配制成一定浓度的菌悬液（浓度为107CFU/mL），采用涂布器将其均匀涂布在供试无菌牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，制成含菌平板[15-17]。将固体样品M1-50%和M2-50%分别用10%吐温80-水溶液二倍稀释配成质量浓度为600、300、150 g/L 的样品溶液；液体样品M1-95%和M2-95%分别用10%吐温80-水溶液二倍稀释配成体积分数为100%、50%、25%的样品溶液。直径为6.0 mm、吸水量为20 μL的专用药敏纸片经高温蒸汽消毒后，使用浸泡的方法将纸片浸泡在样品溶液中，充分吸收2 h，取出冷冻干燥，贴于具有供试菌悬液的琼脂培养基上，细菌在37 ℃培养箱中无光培养24 h，真菌在37 ℃培养箱中无光培养48 h。每个样品重复3 次，选用游标卡尺作为测量每个抑菌圈两个垂直方向直径的工具，以肉眼看不到细菌明显生长作为判断抑菌圈边缘的依据，评价4 个粗提物的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 TTH化学成分分析

通过GC-MS 对M1-95%粗提物进行化学成分分析，并通过标准图谱对比及检索图谱分析，鉴定出22种化学成分，并计算各成分的相对含量，鉴定出匹配度90%以上的化合物含量占93.80%，其中化合物多为烯、醇类。TTH粗提物M1-95%化学成分与含量见表1。

表1 TTH粗提物M1-95%化学成分与含量

由表1可知，M1-95%粗提物中较大峰的化学成分和保留时间分别为：α-蒎烯（6.555 min）、3-蒈烯（9.526 min）、1,8-桉叶素（10.285 min）、γ-松油烯（13.987 min）、α-松油烯（14.483 min）、松油-1-醇（22.145 min）、α-杜松醇（22.412 min）、α-古芸烯（23.186 min）、γ-杜松烯（23.862 min）、hedycaryol（36.480 min），10种化合物总含量占93.48%。

通过GC-MS 对M2-95%粗提物进行化学成分分析，并通过标准图谱对比及检索图谱分析，鉴定出10种化学成分，并计算出各成分的相对含量，鉴定出匹配度90%以上的化合物含量占96.63%，其中化合物多为烯、醇类。TTH粗提物M2-95%化学成分与含量见表2。

表2 TTH粗提物M2-95%化学成分与含量

由表2可知，M2-95%粗提物中较大峰的化学成分和保留时间分别为：α-蒎烯（6.726 min）、1,8-桉叶素（11.394 min）、γ-松油烯（14.529 min）、α-松油烯（15.030 min）、松油-1-醇（22.292 min）、α-杜松醇（23.037 min），6种化合物总含量占89.24%。

2.2 抑菌活性分析

M1-50%和M2-50%抑菌圈直径见表3。由表3 可知，M1-50%对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和肺炎克雷伯菌具有中等强度抑制活性。M2-50%对以上菌株抑制活性较弱。

表3 M1-50%和M2-50%抑菌圈直径 单位：mm

M1-95%和M2-95%抑菌圈直径见表4。由表4 可知，M1-95%对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌具有较强抑制活性。其中，M1-95%对藤黄微球菌的抑菌圈直径分别为34.6、29.6、22.7 mm；M1-95%对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为26.8、22.6、20.6 mm；M1-95%对白色念珠菌的抑菌圈直径分别为33.2、32.6、33.3 mm。M1-95%对大肠埃希菌、副伤寒乙沙门菌、肺炎克雷伯菌、革兰氏阳性菌株金黄葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌和化脓链球菌具有中等强度抑制活性。M2-95%对上述菌株没有抑制活性。

表4 M1-95%和M2-95%抑菌圈直径 单位：mm

3 讨论

3.1 TTH中的化学成分分析

本研究采用大孔吸附树脂对TTH 中的化学成分进行富集，选用D101和AB-8两种大孔吸附树脂，经过D101大孔吸附树脂富集的M1-95%粗提物，主要化学成分为松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉叶素和α-松油烯，经过D101 大孔吸附树脂富集后又再次经过AB-8 大孔吸附树脂富集的M2-95%粗提物，主要化学成分为松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉叶素和α-松油烯。M1-95%粗提物和M2-95%粗提物主要化学成分相同，M1-95%粗提物重量为35 g，M2-95%粗提物重量为2.5 g，重量相差较大。由此可见，D101大孔吸附树脂对TTH中的化学成分具有较强的富集能力，而AB-8大孔吸附树脂并未富集出其他化学成分，表明生产车间无须将流出液再次经过AB-8大孔吸附树脂富集。

3.2 TTH中的化学成分抑菌活性分析

Koh等[8]、Garozzo等[9]、Grando等[10]研究发现，TTH具有抑菌、抗病毒和免疫等药理活性。本研究针对TTH的粗提物进行抑菌活性研究表明，结果显示，M1-95%对革兰氏阳性菌株藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和真菌白色念珠菌具有较强抑制活性，而M2-95%对研究菌株没有抑制活性。原因可能是M2-95%粗提物中没有M1-95%粗提物中含有的抑菌活性成分。

M1-50%对革兰氏阳性菌株藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、真菌白色念珠菌和革兰氏阴性菌株肺炎克雷伯菌具有中等强度抑制活性，M2-50%对研究菌株抑制活性较弱，原因可能是M2-50%粗提物中无M1-50%粗提物中含有的抑菌活性成分。结果再次证实TTH经过D101大孔吸附树脂富集后，无须将流出液再次经过AB-8大孔吸附树脂富集。

4 结论

本研究结果显示，D101大孔吸附树脂对TTH中的化学成分具有较强的吸附能力，而AB-8大孔吸附树脂并没有富集出其他化学成分，表明生产车间无须将流出液再次经过AB-8大孔吸附树脂富集。M1-95%对革兰氏阳性菌株藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和真菌白色念珠菌具有较强抑制活性；M1-50%对革兰氏阳性菌株藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、真菌白色念珠菌和革兰氏阴性菌株肺炎克雷伯菌具有中等强度抑制活性。本研究不仅为TTH 的化学成分富集提供工艺方法，也为其化学成分及抑菌活性研究提供了参考。