发酵饵料对中华圆田螺生长性能和肠道菌群的影响

孙 涛 陈李婷 邓小红 樊荟慧 陈 静 宾石玉，3

（1.广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541006；2.广西全州县水产技术推广站，广西 桂林 541500；3.广西师范大学 珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，广西 桂林 541006）

动物肠道健康状况与肠道菌群的稳态关系密切，肠道菌群变化直接影响动物肠道对饲料营养物质的消化、吸收与代谢，进而影响动物的生产性能。与常规饲料相比，发酵饲料经过微生物分解形成了丰富的次级代谢物，可以提高饲料利用率，具有降低畜禽疾病、提高免疫力、改善畜禽养殖环境等作用[1]。在猪[2]、蛋鸭[3]、肉鸡[4]等畜禽中的研究中发现，发酵饲料能够促进肠道健康，调节肠道菌群结构。中华圆田螺（Cipangopaludina cahayensis）俗称田螺，是一种生活在淡水中的杂食软体动物，生长繁殖迅速，尤其喜欢饵料丰富、土质柔软的稻田环境。田螺肉味道鲜美，含有丰富的蛋白质及多种微量元素，营养价值高[5-6]，是我国稻田养殖的重要水产品种之一[7]。近年来，随着稻螺综合种养产业化发展，仅靠稻田天然饵料养殖，田螺的养殖效益难以得到有效提升。因此，如何提高规模化养殖田螺的生长速度和产量成为研究的热点[8]。研究表明，以米糠为主要原料配制的发酵饵料能够促进田螺生长，提高田螺养殖经济效益[9]。但目前关于田螺发酵饵料的研究较少。本研究以中华圆田螺为研究对象，探讨发酵饵料对其生长和肠道菌群的影响，为田螺发酵饵料的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中华圆田螺由柳州市谷之韵农业发展有限公司里提供，发酵菌液（植物乳酸杆菌、酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌比例为1.5∶1.0∶1.0）由广西科技大学提供。

发酵饵料配制：按照基础饵料∶菌液比为5∶1将发酵菌液加入基础饵料中，搅拌均匀，28 ℃恒温培养箱中发酵7 d，4 ℃冰箱保存。发酵饵料的有效活菌数为1.02×1011CFU/kg，基础饵料组成及营养水平见表1。

表1 基础饵料组成和营养水平（风干基础） 单位：%

1.2 试验设计与饲养管理

选择约25 g 的中华圆田螺60 只，随机分为2 组，每组3 个重复，每个重复10 只螺。将田螺分别放入塑料养殖盆中，水量为浸没过螺5 cm，保持25 ℃室温。每天8：00、20：00 投喂饵料，投喂量为田螺体重的0.05%，每次投喂前用清水冲洗养殖盆，保持洁净。A 组和B 组田螺分别饲喂基础饵料和发酵饵料。试验期20 d。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 样品采集与处理

2.3.1 发酵饵料对中华圆田螺肠道门水平相对丰度的影响（见表4）

在新一代技术融合图书馆服务的实践中，手机技术是应用广泛而投入较小的。我团队于2016年与本地一家公司合作，围绕纸质图书服务设计了10多种功能，实施效果良好。基于此，该项目在2018年6月获得了全国高校应用案例二等奖。

1.3.3.2 建库测序

随着电力系统日益庞大，边界条件增多，运行方式日趋复杂，其动态运行的非线性递增，出现大停电的可能性在上升，应该考虑大停电事件出现后的应对措施。而大力发展分布式能源及能源互联网是应对大停电事件技术防范的重要举措。当然，还应考虑停电时天然气输送系统的正常运行和天然气分布式能源黑启动的技术配备，真正起到应急作用。

式中：W0为初重（g）；Wt为末重（g）；t为饲养天数（d）；Nt为终末只数；N0为初始只数；Wf为饵料摄入量（g）；Wp为饵料蛋白质含量（%）。

1.3.3 高通量测序

1.3.3.1 样品DNA提取

利用粪便DNA提取试剂盒进行提取，具体步骤参照试剂盒的说明书进行操作。采用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪检测DNA的完整性、浓度和纯度。

从表2可以看出，存在亚健康状况的学生中膀胱能量阻滞的现象比较少见，主要存在的问题是能量不足，其中男生11人，女生26人，占亚健康总人数的74%.膀胱能量不均衡的人容易出现背部疼痛、小便异常的现象，情况严重者还可能出现记忆力减退的状况.

1.3.2 生长性能

由表5可知，中华圆田螺肠道排名前5的菌属为变形菌属、拟杆菌属、厚壁菌属、软壁菌属和衣原体。与A组相比，B组中华圆田螺丰度前5菌属的相对丰度均有提高，其中厚壁菌属和衣原体显著提高（P＜0.05）。

1.4 数据统计与分析

将测序得到的原始数据进行质控、过滤、去嵌合体，得到有效数据。基于有效数据进行OTU 划分和物种注释，得到对应的物种信息和丰度情况，并作物种多样性及组间差异分析。

财务预算管理的全面实施需要企业能够制定出有效、详细的可实施方案，方案中要包含具有的实施步骤以及相应的考评机制，通过合理、科学的财务指标对实施的结果进行评价，以此来确保预算的及时性和高效性。通过预算控制还能够避免员工工作积极性不高的问题，通过对国有企业所有管理者、员工进行考评，从而来刺激其工作的积极性。

试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's 法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 发酵饵料对中华圆田螺生长性能的影响（见表2）

表2 发酵饵料对中华圆田螺生长性能的影响

由表2 可知，两组田螺的成活率均为100%。与A 组相比，B 组田螺的WGR、SGR 和PER 均有所提高，FCR降低（P＞0.05）。

2.2 发酵饵料对中华圆田螺肠道内容物测序序列及OTU的影响（见表3）

表3 发酵饵料对中华圆田螺肠道内容物测序序列及OTU的影响

由表3 可知，通过高通量测序得到有效序列共375 141 条，序列长度范围为416～455 bp。将有效序列进行聚类并划分，对OTU进行统计，发现各组样品的OTU覆盖率均在99.9%以上，表明该测序能够真实反映各组样品的微生物组成。

2.3 发酵饵料对中华圆田螺肠道菌群组成的影响

试验结束后禁食24 h，每个重复分别进行计数和称重，统计饵料用量。每个重复田螺在无菌环境下解剖，取肠道内容物置于无菌袋中，液氮中速冻，-80 ℃保存。

试验开始和结束，统计田螺的数量及重量，计算增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、饵料系数（FCR）、蛋白质效率（PER）和成活率（SR）。

表4 发酵饵料对中华圆田螺肠道门水平相对丰度的影响 单位：%

肠道微生物物种分析显示，所有样品中发现微生包含32个门、54个纲、142个目、214个科、397个属。

快递市场鱼龙混杂，与快递业法规建设和标准制定滞后有一定关系，虽然2008年国内首个《中华人民共和国邮政行业标准》出台，由于《标准》是推荐性的，并不具备法律强制力约束，多数快递企业采取对其“视而不见”的态度，仅仅一部行业标准是远远不够的，应通过各种形式和各种方式向政府、人大及社会公众发出建言建议，促使人大、政府出台相关的实施细则等法律法规，进一步规范和引导快递行业。

由表4 可知，通过聚类分析及物种注释发现，A 组、B组田螺肠道丰富度最高的前6个细菌门类依次为变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、酸杆菌门、放线菌门和绿弯菌门，占总OTU 数的85%～89%。在门分类水平上，A 组、B 组田螺肠道菌门的相对丰富差异均不显著（P＞0.05）。

煤矿业中使用防爆柴油机无轨胶轮车时，要进行严格的检验。检测项目要做到主次分明，有重要项目，有次要项目，要严格遵守检测标准，采用先进仪器设备，针对重点项目细致检测。另一方面，防爆柴油机无轨胶轮车的安全生产检测，不仅能快速发现安全隐患，又能够加强无轨胶轮车的运输监管力度，预防危险事故的发生。最后，开展安全性能检测，不仅可以预防煤矿业工程作业过程中出现意外事故，而且可以为实施单位带来巨大经济效益、社会效益，发展前景良好。

2.3.2 发酵饵料对中华圆田螺肠道属水平相对丰度的影响（见表5）

表5 发酵饵料对中华圆田螺肠道属水平相对丰度的影响单位：%

提取样品总DNA 后，根据16S rDNA V4-V5 区设计得到前端引物序列为-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，后端引物序列为-GGACTACNVGGGTWTCTAAT。在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增。采用GeneTools AnalysisSoftware 对PCR 产物进行纯化、定量和均一化，形成测序文库，质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500高能量测序平台进行测序，测序工作在广东美格基因科技有限公司完成。

能源供需情况：2020年、2025年和2030年的能源需求缺口分别为4 225万tce、6 615万tce和 10 215 万tce，能源缺口不断增大。

2.4 发酵饵料对中华圆田螺对肠道菌群Alpha 多样性的影响（见表6）

表6 发酵饵料对中华圆田螺对肠道菌群Alpha多样性的影响

Chao1指数数值越大，物种越丰富；Simpson 数值越大，物种多样性越高。

采用时长T对机会通信产生的连续数据进行切片,生成一系列离散的拓扑快照图,时长T的大小对实验结果的精度有很大的影响,T值的选取是切片的关键.

由表6 可知，B 组肠道菌群的OTU 数量、Chao1 指数、Simpson 指数均高于A 组（P＞0.05），表明投喂发酵饵料提高了中华圆田螺肠道微生物群落多样性和丰度。

3 讨论

3.1 发酵饵料对中华圆田螺生长性能的影响

生长性能是评价发酵饲料营养状况及经济效益的重要指标。研究表明，发酵饲料能够提高饲粮的营养价值，改善适口性，促进动物采食，提高动物生长性能。原因是发酵过程中添加的菌种能够改善动物肠道菌群，且在代谢过程中产生多种营养物质（如氨基酸、蛋白质和有机酸等）[10-11]，可以改善饵料品质，激活淀粉酶、蛋白酶等与碳水化合物和蛋白质代谢相关的消化酶，加快鱼、虾对营养物质的消化吸收[12-13]，进而提高生长性能。本试验研究发现，发酵饵料组中华圆田螺的WGR、SGR、PER 和FCR 均高于对照组，表明发酵饵料在一定程度上促进了中华圆田螺的生长。有研究表明，厚壁菌门在肠道中的主要作用是促进碳水化合物和蛋白质水解[14]，因此推测投喂发酵饵料提高了肠道中厚壁菌门微生物丰度，从而对营养消化吸收具有一定的促进作用，提高了田螺的生长性能。

3.2 发酵饵料对中华圆田螺肠道菌群的影响

本研究对中华圆田螺肠道菌群的V4～V5 区进行扩增测序，得到的序列片段长度在416.28～454.99 bp 范围内，符合该区域的片段要求，并获得大量有效信息序列；基于OTU在门水平的分类表明，中华圆田螺肠道菌群包含32 个门、54 个纲、142 个目、214 个科、397 个属，其中丰富度最高的是变形菌门和拟杆菌门，结果与大部分水产动物肠道微生物丰度相似。变形菌门是许多淡水及海水鱼类肠道菌群中非常丰富的门[15]。鲟鱼[15]的前肠道菌群中变形菌门丰度高达75%。牛蛙[16]肠道菌群中，梭杆菌门、厚壁菌门和变形菌门丰度占99%以上。日本沼虾[17]的肠道微生物中变形菌门丰度最高，其次是厚壁菌门。日本鳗鲡[18]肠道中的变形菌门和厚壁菌门丰度最高。目前关于水产动物肠道菌群的相关研究较少。本研究结果可为淡水螺类肠道微生物研究提供了一定参考，对田螺饵料开发、饲养环境的选择、消化病理研究具有一定的参考价值。

肠道菌群是数量和种类非常庞大的微生物群体，在维持正常的消化吸收、免疫防御等功能中具有重要作用。在具体功能上，有研究表明变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门能够分泌促进消化的酶[19]，放线菌能够在一定程度上影响生物的生理与代谢[20-21]。而肠道菌群的相对丰度高则利于维持肠道微生物菌群稳态，进而促进肠道健康，有利于提高生长性能[13]。本研究中，与基础饵料组相比，发酵饵料组的OTU 数目、Chao1 指数、Simpson指数均得到提高，表明发酵饵料更利于提高中华圆田螺的肠道微生物丰度，推测发酵饵料对促进中华圆田螺肠道健康具有一定的积极作用；在两组的丰度前5的细菌组成对比中发现，发酵饵料组中华圆田螺肠道中优势菌属变形菌属、拟杆菌属、厚壁菌属、软壁菌属和衣原体的相对丰度均提高，其中厚壁菌和衣原体显著提高。

4 结论

在本试验条件下，与未发酵基础饵料相对比，发酵饵料可以提高中华圆田螺的生长性能、肠道微生物群落的多样性和丰度。