TIMELESS、RAB2A、ASPM 在乳腺癌组织中的表达及与临床特征相关性

刘起鹏 张 婷 郭婉莹

河南科技大学第一附属医院 （洛阳 471000）

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，发病人群多为女性，据数据显示［1-2］，近年来，随着人们饮食习惯和生活习惯的改变、工作压力的增大，乳腺癌的患病率呈逐年上升的趋势，已对患者生命安全造成严重威胁。乳腺癌的发生发展过程中，机体内众多生长因子、细胞因子及体内激素发生改变，分子生物学技术水平日益提升，再加之分子检测具有无创性，更易被患者接受，在临床疾病评估和预后判断中具有重要作用［3-4］。故从分子水平深入研究乳腺癌潜在的发生、发展机制，在一定程度上有助于辅助疾病诊断、评估疾病治疗效果，还对延长患者生存周期具有促进作用［5］。本文研究中对比TIMELESS、鼠肉瘤病毒家族相关蛋白2A（murine sarcoma virus family-related protein 2A，RAB2A）、异常纺锤体样小头畸形相关基因（abnormal spindle-like microcephaly，ASPM）在乳腺癌组织、正常乳腺组织中表达及与临床特征的相关性，旨在寻找诊断乳腺癌的有效分子标志物，为此病的诊断、治疗及预后判断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019年2月—2021年2月我院乳腺癌组织标本84例作为研究组，年龄25～76岁，正常乳腺组织标本53例作为对照组，年龄28～74岁。2组年龄、BMI、吸烟、饮酒、初发肿瘤、复发肿瘤比较（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究已获得我院伦理委员会批准。

表1 临床基线资料比较

纳入标准：符合《中国进展期乳腺癌共识指南（CABC 2015）》［6］中乳腺癌诊断标准；所有标本均为根治性手术治疗获得。

排除标准：合并其他系统恶性肿瘤及肝肾功能障碍者；未按医嘱接受治疗；病例资料不全；合并血液系统疾病；有中枢神经系统转移疾病、此前经全身化疗或免疫疗法治疗者。

1.2 指标检测

1.2.1 主要仪器和试剂 仪器：生物组织包埋冷冻台购自生物组织包埋冷冻台（货号：SPCC-6LA）。试剂：提取总RNA试剂盒购自上海科敏生物科技有限公司（货号：73404）。

1.2.2 TIMELESS、ASPM检测 TIMELESS、ASPM采用荧光定量聚合酶检测，将RNA反转录为cDNA，条件：25 ℃、50 ℃、85 ℃（10 min、45 min、5 min）。cDNA进行扩增，引物序列：TIMELESS，F：5′-GGTTCGAGAGATGACTGAGGGCTAT-3′，R：5′-TCCAGGGTAGCTTAGTCC T T T C A A A-3′；引物序列：A S P M，F：5′-T C C G A A G T T G T A A T C G C A G T-3′，R：5′-GTTGCAGGGGATTTGTGATT-3′。以U6为内参，F：5′-GGTTAGAAGTCATACG-3′，R：5′-TGTCATGAATGATCC-3′。反应体系为：10 μL BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（2×），2 μL cDNA模板，1 μL上下游引物和6 μL H2O。产物扩增条件：95 ℃预变性、变性均5 min，95 ℃退火、72 ℃延伸分别15 s、30 s，共40个循环，TIMELESS、ASPM相对表达量采用2-ΔΔCt计算。

1.2.2 RAB2A检测 RAB2A采用Western blot检测RAB2A蛋白表达情况，用RIPA裂解液裂解后进行蛋白抽提，接着进行分离胶浓度为12%的SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗4 ℃孵育过夜，第二天TBST洗膜，孵育二抗，再次洗膜后，加ECL曝光。一抗稀释度RAB2A（1∶1 000）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 26.0处理。用Kolmogorov-Smirnov检验数据是否符合正态分布，符合则计量资料使用（±s）进行描述，组间两两比较采用独立t检验，多组间行F值数据计算，计数资料以%表示，Pearson相关性分析TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌的相关性，以Logistic回归模型分析TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌的关系，P＜0.05为具有统计学差异。

2 结 果

2.1 临床基线资料比较

研究组年龄、BMI、有饮酒史、有吸烟史、初发肿瘤、复发肿瘤与对照组无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

2.2 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中表达比较

研究组TIMELESS、ASPM比对照组高，RAB2A比对照组低（P＜0.05）。见表2。

表2 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中表达比较 （±s）

表2 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中表达比较 （±s）

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2.3 TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌临床特征相关性

TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径无关（P＞0.05），TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌淋巴结浸润、TNM分期、分化程度相关（P＜0.05）。见表3。

表3 TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌临床特征相关性 （±s）

表3 TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌临床特征相关性 （±s）

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续表

表3 TIMELESS、RAB2A、ASPM与乳腺癌临床特征相关性 （±s）

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2.4 乳腺癌影响因素的多元Logistic回归分析

乳腺癌为因变量（未发生=0，发生=1），TIMELESS、RAB2A、ASPM为自变量，赋值升高设为1，正常设为0，纳入二分类多因素Logistic回归模型分析，结果显示，TIMELESS、RAB2A、ASPM为影响乳腺癌发生的危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 乳腺癌发生影响因素的多元Logistic回归分析

2.5 TIMELESS、RAB2A、ASPM之间相关性分析

以TIMELESS、RAB2A、ASPM进行相关性分析，结果显示，TIMELESS、RAB2A负相关（r=-0.383、P=0.001）；TIMELESS、ASPM正相关（r=0.397、P=0.001）；RAB2A、ASPM负相关（r=-0.257、P=0.018）。见图1。

2.6 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中诊断价值比较

与TIMELESS、RAB2A、ASPM单一检测相比，TIMELESS、RAB2A、ASPM联合检测对乳腺癌的诊断价值较高（P＜0.05）。见表5、图2。

图2 TIMELESS、RAB2A、ASPM 三项联合水平诊断乳腺癌ROC 图

表5 TIMELESS、RAB2A、ASPM在乳腺癌中诊断价值比较

3 讨 论

据数据显示［7-8］，全球乳腺癌的发病例高达约226万例，已替代肺癌位居全球第一大癌，此病是一种发生于乳腺上皮细胞的恶性肿瘤，具有高度的时间、空间异质性，此病的发病率、死亡率均较高，一方面对女性的生理健康造成威胁，另一方面加重患者及其家属经济负担。因乳腺癌在早期时无典型症状和体征，难以引起患者重视，少数患者在确诊时已出现远处转移的现象，故尽早诊断乳腺癌在一定程度上有助于降低癌症死亡率。目前临床上首选治疗方案为保守治疗，有助于延长患者生命周期；但立足于癌细胞的总负荷而言，手术治疗效果更佳，但手术治疗存在创伤性［9］。分子标记物由于其非侵入性，更易被广大患者所接受，故被应用于大多数癌症的早期诊断和预后评估中。至今，临床上多用于诊断乳腺癌的分子标记物为多为CEA、CA153、HCY，但灵敏度、特异度均不高，在临床上仅用于辅助诊断，寻找合适的乳腺癌分子标志物依旧是未来研究的热点［10-11］。

临床研究显示［12-13］，存在于自然界的所有生物对具有周期性的生存环境会做出适应性反应，即生物昼夜节律，昼夜节律是机体内细胞日夜交替自我调节的一种内源性适应机制，在维持生命活动方面具有重要价值；若生物钟紊乱易增加机体患多种疾病的风险，如在恶性肿瘤中，生物节律异常，则癌细胞呈失控性增长，对疾病的发生发展起促进作用。TIMELESS在肝癌、胃癌、直肠癌、宫颈癌等多种肿瘤中表达具有特异性，如在直肠癌中TIMELESS呈高表达，且其表达与患者肿瘤大小、分化情况、TNM分期、生存情况密切相关，临床借助于检测TIMELESS水平变化评估患者病情、预估预后情况［14］。本文结果显示，TIMELESS在乳腺癌中表达显著升高，且与乳腺癌淋巴结浸润、TNM分期、分化程度等临床特征相关是乳腺癌发生的的危险因素之一，与上述研究结果一致，但在本文研究中并未对TIMELESS具体作用机制进行探究，在后续研究中有待深入挖掘。

RAB2A属于小GTPase家族的主要成员之一，可调节囊泡转运、内质网的回收及运动，在口腔鳞状细胞癌中可介导MAPK信号通路，对口腔鳞状细胞癌细胞的运动、侵袭起调控作用，进而调节口腔鳞状细胞癌的发生、发展，有望成为评估疾病进展的分子标志物［15］。黄国定［16］等人研究显示，RAB2A是RAS蛋白家族的主要成员之一，其在胃癌组织中表达量显著上升，推测RAB2A是一个潜在的原癌基因，且其表达变化与患者生存周期密切相关，即低表达患者生存情况显著优于高表达患者，其作用机制可能通过调节Erk信号通路。RAB2A是内质网到高尔基体转运的必需蛋白，在乳腺癌中对蛋白水解活性具有促进作用，对乳腺癌细胞的3D侵袭性具有调节作用，有望成为乳腺癌患者疾病复发的有力且独立的预测分子标志物［17］。本文研究结果显示，RAB2A在乳腺癌组织中呈低表达且乳腺癌淋巴结浸润、TNM分期、分化程度密切相关，临床检测其水平有助于辅助疾病诊断。

有研究显示［18］，在增殖组织和肿瘤组织中ASPM呈显著高表达且其水平变化与肿瘤细胞生物学行为、复发和预后相关。临床研究显示［19-20］，肝癌、肺腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中ASPM表达水平与正常组织存在特异性，如肺腺癌组织中ASPM表达显著高于肺良性病变肺组织，且其水平变化与患者肿瘤大小、不良预后相关，临床可通过检测其水平变化评估肺腺癌的发生发展，采取有效治疗措施，改善患者预后。本文数据显示，乳腺癌组织中ASPM表达显著高于正常乳腺组织，与上述研究结果一致，且其水平变化与淋巴结浸润、TNM分期、分化程度相关，临床可通过检测ASPM水平变化为乳腺癌治疗提供新靶点和理论支撑。

综上所述，本文结果显示，乳腺癌组织中TIMELESS、ASPM表达显著升高，RAB2A表达显著降低，且其水平变化与年龄、肿瘤直径无统计学差异，与乳腺癌淋巴结浸润、TNM分期、分化程度密切相关，早期检测可作为临床辅助诊断乳腺癌和评估病情的重要指标，具有重要的临床参考价值。但本文研究仍存在不足之处，如样本量小、研究对象单一、病例来源受地域限制，故在今后研究中需增加样本量、纳入多中心研究对象并扩大病例来源范围，以证实本文研究的准确性。