异丙酚对卵巢癌进展和顺铂敏感性的影响及机制*

刘琴, 王莉娜, 代委桀, 黄浩, 袁茜

(自贡市妇幼保健院 麻醉科, 四川 自贡 643000)

卵巢癌是女性最常见的三大恶性肿瘤之一,死亡率位居女性肿瘤的榜首,因早期症状不明显难以被准确诊断,发病率呈逐年上升趋势。卵巢癌根据病理类型不同,治疗方法有所差异,但大多采用手术结合化疗进行治疗[1-3]。由于卵巢癌具有易产生多药耐药的生物学特性,因此寻找靶点精确、治疗高效、毒性较低的化疗药物以及有效的化疗药物增敏剂逐步成为肿瘤研究领域的热点[4]。顺铂(cis-platinum,DDP)及其同类药物在临床治疗恶性肿瘤方面已得到广泛应用,并取得良好治疗效果,但DDP具有浓度依赖性的弊端,即短时间内给药浓度越大,疗效越高[5]。DDP本身性质决定其在抑制肿瘤生长的同时,具有耳毒性、肾毒性及神经毒性等强烈副作用,当给药浓度过大时,极易造成患者强烈不耐受,因此治疗过程中需对DDP浓度进行严格把控,导致的直接结果之一便是因限制DDP最大剂量而造成的疗效下降[6-7]。异丙酚对卵巢癌细胞具有抑制作用,但和其他化疗药相同,也面临着药物耐药性这一严峻问题。因此,寻找能够增加化疗药敏感性,降低耐药可能性对于临床化疗具有非常重要的临床现实意义。已有研究显示,异丙酚在肝细胞中可减缓DDP副作用,对减轻药物依赖性具有正向作用,目前应用于卵巢癌的研究仅限于探讨其对卵巢癌细胞侵袭和转移的机制[8-9],但能否在卵巢癌细胞中显示出减少DDP细胞毒性作用、提高对DDP耐药的敏感度尚需探究,因此本研究通过观察异丙酚对卵巢癌细胞进展、肿瘤恶性生物学行为及DDP敏感性的影响,旨在为完善卵巢癌临床化疗方案提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞株和实验动物 卵巢癌细胞A2780和耐DDP卵巢癌细胞A2780(A2780/DDP)均购自上海慧颖生物科技有限公司;BALC/c裸鼠20只,雌性,无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级,5～7周龄,体质量(200±20)g,由四川省医学科学院&四川省人民医院实验动物研究所提供[生产许可SCXK(川)2018-15]。

1.1.2主要试剂 异丙酚(西安力邦制药有限公司,国药准字H20040300,规格50 mL∶500 mg),DDP(齐鲁制药有限公司,国药准字H37021357,规格20 mg),RPMI-1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;美国GIBCO公司),细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测试剂盒(上海经科化学科技有限公司),辣根过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)标记兔抗鼠二抗、β-actin鼠单克隆抗体、大鼠B细胞淋巴瘤-XL(rat B-cell lymphoma -XL,Bcl-xl)单克隆抗体、细胞凋亡调节因子(bcl-2interactingmediatorofcelldeath, Bim)单克隆抗体及活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)单克隆抗体(美国Abcam公司)。

1.1.3主要仪器 CO2培养箱(美国Thermo Fisher Scientific),奥林巴斯BX53型生物显微镜和C2500-R-230V微型高速离心机(美国Labnet),Multiskan MK3全自动酶标仪(美国Thermo scientific)及FACS Calibur流式细胞分析仪(美国BD)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养及分组 采用含体积分数10%FBS的RPMI-1640培养基复苏A2780和A2780/DDP细胞、传代培养至对数生长期(2×106个/L),细胞分为Control组(等量培养基)、异丙酚组(加10 mg/L 异丙酚)、DDP组(加10 μmol/L DDP)及异丙酚+DDP组(加10 mg/L异丙酚及10 μmol/L DDP),置于pH 7.0～7.2的37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2CCK-8法检测细胞的增殖 取对数生长期的A2780和A2780/DDP细胞接种于96孔培养板中,分别与0、1、5、10、20 mg/L异丙酚及0、5、10、20、40、80 μmol/L DDP进行孵育,预培养于37 ℃、5% CO2培养箱,加CCK-8溶液10 μL/孔,培养4 h,在波长为450 nm处,检测各孔的吸光度值,绘制细胞生存率随浓度变化的生长曲线。

1.2.3克隆形成实验检测细胞生长 取“1.2.1”项下各组对数生长期A2780和A2780/DDP细胞接种于96孔培养板中,37 ℃的5% CO2培养箱中培养24 h,采用多聚甲醛(质量分数4%)室温固定10 min,1%结晶紫染色5 min,显微镜下观察每孔内细胞克隆数目,计算克隆细胞数。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 利用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化收集“1.2.1”项下各组对数生长期A2780和A2780/DDP细胞,终止消化后清洗细胞;加Binding Buffer 结合缓冲液 500 μL、异硫氰酸荧光素5 μL、碘化丙啶 5 μL,避光 10 min,使用流式细胞仪检测,CellQest软件分析各组细胞的凋亡情况。

1.2.5Western blot检测凋亡蛋白表达 利用Western blot检测Bcl-xl、Bim及cleaved caspase-3蛋白表达水平。分别取“1.2.1”项下各组对数生长期A2780和A2780/DDP细胞,加放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液提取总蛋白,采用Beyotime细胞质蛋白提取试剂盒提取细胞质蛋白,Beyotime核蛋白提取试剂盒获得核蛋白,将蛋白质进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分离,转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜;孵育膜与封闭缓冲液,洗涤,加一抗Bcl-xl(1∶2 000)、Bim(1∶2 000)、cleaved caspase-3 (1∶2 000),4 ℃孵育过夜。洗膜,使用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)偶联的二抗(1∶5 000)孵育膜,室温孵育2 h,洗膜,电化学发光显像,β-actin为内参,采用凝胶图像分析系统对比条带强弱。

1.2.6Transwell检测细胞的侵袭 取“1.2.1”项下各组对数生长期A2780和A2780/DDP细胞,以无血清RPMI-1640培养基稀释至5×108个/L, Matrigel基质胶100 μL与无血清培养基500 μL充分混合,吸取50 μL置于上室,恒温37 ℃静置4 h,下室加含10 % FBS的RPMI-1640培养基500 μL,培养24 h,无菌棉签除去多余细胞,甲醛固定15 min,结晶紫染色15 min,显微镜观察并记录迁移的细胞数。

1.2.7裸鼠移植瘤实验 SPF条件下,20只裸鼠皮下注射卵巢癌A2780细胞株(8×109个/L)0.2 mL,构建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型。造模成功后的裸鼠均分为Control组(等量生理盐水)、异丙酚组(10 mg/L 异丙酚)、DDP组(10 μmol/L DDP)及异丙酚+DDP组(10 mg/L异丙酚及10 μmol/L DDP),以上各处理均为腹腔注射、100 mg/(kg·次)、1次/2 d;每隔5 d采用卡尺测量各组裸鼠移植瘤瘤体长短径并计算体积,观察30 d;第30天处死全部裸鼠,剥离肿瘤称量瘤体质量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞活力

与同类细胞0 mg/L组相比,5、10及20 mg/L组A2780、A2780/DDP细胞株细胞活力均明显下降(P<0.05);A2780/DDP细胞系半抑制浓度(50% inhibiting concentration,IC50)为(16.63±2.39)mg/L,高于A2780细胞系[(13.27±1.68)mg/L,P<0.05]。DDP>5 μmol/L时A2780细胞株细胞活力随浓度上升而下降(P<0.05),DDP>10 μmol/L时A2780/DDP细胞株细胞活力随浓度上升而下降(P<0.05);A2780/DDP细胞系IC50为(43.91±3.78)μmol/L,高于A2780细胞系[(14.31±1.05)μmol/L,P<0.05];与A2780/DDP细胞系相比,不同浓度异丙酚和DDP下的A2780细胞系细胞存活率较低。见图1。

注:A、B为不同浓度异丙酚下细胞存活率和IC50值,C、D为不同浓度DDP下细胞存活率和IC50值;(1)与同类细胞1 mg/L组比较,P<0.05;(2)与同浓度A2780组比较,P<0.05。图1 不同浓度异丙酚和DDP对A2780、A2780/DDP细胞活力的影响Fig.1 Effects of different concentrations of propofol and DDP on the activity of A2780 and A2780/DDP cells

2.2 细胞毒性作用

与Control组相比,异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞系细胞活力和细胞克隆数均下降(P<0.05);与DDP组相比,异丙酚+DDP组A2780、A2780/DDP细胞系细胞活力和细胞克隆数均下降(P<0.05);与A2780/DDP细胞系相比,A2780细胞系细胞克隆数较低。见图2。

注: A、B为细胞A2780和A2780/DDP的细胞存活率;C、D为细胞克隆形成(结晶紫染色,×40)及其定量结果;(1)与Control组比较,P<0.05;(2)与DDP组比较,P<0.05。图2 异丙酚增强DDP对A2780、A2780/DDP细胞系细胞毒性作用Fig.2 Effects of propofol-enhanced DDP on cytotoxicity of A2780 and A2780/DDP cell lines

2.3 DDP敏感性

异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞凋亡率均较Control组上升(P<0.05),异丙酚+DDP组A2780、A2780/DDP细胞凋亡率均较DDP组上升(P<0.05),A2780细胞系细胞凋亡率较A2780/DDP细胞系高(P<0.05);异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞中Bim和cleaved caspase-3表达均较Control组上升、Bcl-xl表达则下降(P<0.05),异丙酚+DDP组A2780、A2780/DDP细胞中Bim和cleaved caspase-3表达均较DDP组上升、Bcl-xl表达则下降(P<0.05)。见图3。

注:A、B为流式细胞仪检测结果及定量结果,C、D为各组A2780细胞中凋亡相关蛋白表达及定量结果,E、F为各组A2780/DDP细胞中凋亡相关蛋白表达及定量结果; (1)与Control组比较,P<0.05;(2)与DDP组比较,P<0.05。图3 各组A2780和A2780/DDP细胞的凋亡率及凋亡相关蛋白的表达Fig.3 Apoptosis rate and apoptosis-related protein expression of A2780 and A2780/DDP cells in each group

2.4 细胞侵袭实验结果

与Control组相比,异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞侵袭率均下降(P<0.05);与DDP组相比,异丙酚+DDP组A2780、A2780/DDP细胞侵袭率均下降(P<0.05)。见图4。

注:A、B为细胞A2780的细胞侵袭染色结果和定量结果,C、D为细胞A2780/DDP的细胞侵袭染色结果和定量结果;(1)与Control组比较,P<0.05;(2)与DDP组比较,P<0.05。图4 各组A2780和A2780/DDP细胞侵袭实验结果(结晶紫染色法,×400)Fig.4 Results of inhibiting invasion in A2780 and A2780/DDP cells of each group(crystal violet staining,×400)

2.5 裸鼠移植瘤实验

与Control组相比,异丙酚组、DDP组和异丙酚+DDP组裸鼠肿瘤质量明显下降(P<0.05);与DDP组相比,异丙酚+DDP组裸鼠肿瘤质量明显下降(P<0.05);各组肿瘤体积随时间增加而增加,第30天时异丙酚组、DDP组和异丙酚+DDP组裸鼠肿瘤体积小于Control组(P<0.05),异丙酚+DDP组裸鼠肿瘤体积小于DDP组(P<0.05)。见图5。

注:A为体外移植瘤,B为移植瘤质量,C为移植瘤体积与时间变化的关系曲线;(1)与Control组比较,P<0.05;(2)与DDP组比较,P<0.05。图5 异丙酚增强DDP对体内肿瘤生长的抑制作用Fig.5 Propofol increased inhibition effect of tumors growth in vivo by enhancing DDP

3 讨论

异丙酚是近年临床应用广泛于麻醉诱导、静脉镇静的药物,但目前研究发现其作用远不止于此。卵巢癌的发生发展与许多信号通路有关,已有大量研究证实异丙酚能够通过调节这些信号抑制卵巢癌细胞侵袭、迁移和血管生成等恶性生物学行为。肿瘤治疗中也面临耐药性的问题[10-15],既往研究显示,异丙酚能够抑制卵巢癌耐药细胞增殖,提高耐药细胞株对药物的敏感度[16]。为了验证异丙酚是否提高DDP耐药的卵巢癌细胞的敏感性,进行了本研究。

本研究结果显示,与同细胞1 mg/L组相比,3、4、5 mg/L组A2780、A2780/DDP细胞株细胞活力均下降,A2780/DDP细胞系IC50高于A2780细胞系。说明一定浓度的异丙酚能够抑制卵巢癌细胞生长,对DDP耐药株也有抑制效果,但所需浓度更高。 A2780/DDP细胞系IC50高于A2780细胞系,说明DDP对敏感A2780细胞株显示出良好的抑制生长作用,但对DDP耐药的A2780/DDP细胞株需要提高DDP浓度才能发挥抑制生长作用。与A2780/DDP细胞系相比,不同浓度异丙酚和DDP下的A2780细胞系细胞存活率均较低,说明异丙酚和DDP对敏感卵巢癌细胞具有更好抑制作用,但这种抑制作用会因卵巢癌细胞对DDP耐药而降低,提示临床应合理用药进行化疗,避免出现耐药而导致治疗进展困难[17]。本研究结果显示,与Control组相比,异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞系细胞活力和细胞克隆数均下降;说明异丙酚和DDP干预均能够明显抑制卵巢癌细胞的细胞活力。当同时加入异丙酚和DDP时,A2780、A2780/DDP细胞系细胞活力和细胞克隆数相较于加入单一药物干预进一步下降,说明异丙酚能够增强DDP对敏感和耐药A2780细胞系的细胞毒性作用,发挥协同作用,发挥更强大的抑制作用。

本研究结果显示,与Control组相比,异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞凋亡率均上升,说明异丙酚和DDP能够促进细胞凋亡,延缓卵巢癌细胞进展;与DDP组相比,异丙酚+DDP组A2780、A2780/DDP细胞凋亡率均上升,揭示异丙酚能够通过促进细胞凋亡的方式,增强敏感和耐药A2780细胞系对DDP的敏感性,从而发挥肿瘤抑制作用。既往研究表明,异丙酚能通过调控miRNA表达,抑制MAPK/ERK信号通路的关键蛋白p-MAPK及p-ERK表达等途径促进肿瘤细胞凋亡[18],与本研究结果基本一致;与A2780/DDP细胞相比,A2780细胞总是显示出更高的凋亡率,说明无论是使用单一药物干预还是组合干预,敏感肿瘤细胞的抑制作用均强于耐药肿瘤细胞系;通过加入异丙酚,DDP耐药卵巢癌细胞的细胞凋亡率增加,说明异丙酚能够提高DDP敏感性,在实际临床应用中,或许能够增强长期使用DDP化疗方案,有DDP耐药倾向和已经发生DDP耐药患者的治疗效果。

通过研究凋亡相关蛋白的表达与异丙酚的关系,可以从蛋白表达角度建立细胞凋亡和异丙酚的关系,进一步探究异丙酚的加入是否与DDP敏感性的提高有关。与Control组相比,异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞中Bim和cleaved caspase-3表达均上升,Bcl-xl表达下降。Bcl-2家族是公认的与细胞凋亡过程紧密相关的凋亡调节蛋白,通过调控线粒体细胞凋亡途径介导细胞凋亡[19]。Bim属于含有一个BH结构域的Bcl-2家族成员,目前发现多达19种亚型,具有不同促凋亡活性,研究表明Bim基因多态性对晚期NSCLC行铂类药物化疗的患者预后产生明显影响[20-21],因此推测这种影响一定程度上会在卵巢癌细胞中延续。Bcl-xl属于Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员,目前公认细胞凋亡主要由死亡受体通路和线粒体两条通路构成,其共同组成部分则为Caspase激活,使得Caspase-3在细胞凋亡过程中具有不可替代的地位[22-23]。正常情况下,Caspase-3以procaspase的形式存在体内,当受到刺激后,Caspase-3被多种因素活化,活化后的Caspase-3快速参与细胞凋亡过程[24-25]。本研究结果表明异丙酚和DDP能够通过上调Bim表达诱导细胞凋亡,激活Caspase-3活化过程,使DDP耐药肿瘤细胞株也发生细胞凋亡,促进了DDP治疗作用的提高,有利于对抗DDP耐药性造成的治疗效果不佳。与DDP组相比,A2780、A2780/DDP细胞中Bim和cleaved caspase-3表达均明显上升,Bcl-xl表达明显下降,说明异丙酚能够通过调控细胞凋亡相关蛋白的表达水平,介导肿瘤细胞凋亡,提高敏感和耐药细胞株对DDP的敏感性,从而发挥肿瘤抑制作用,对抗因发生耐药性引起的治疗效果下降。

本研究结果显示,与Control组相比,异丙酚组和DDP组A2780、A2780/DDP细胞侵袭率均下降,异丙酚+DDP组A2780、A2780/DDP细胞侵袭率进一步下降,揭示异丙酚和DDP能够抑制肿瘤细胞侵袭,而异丙酚能通过抑制侵袭行为增强敏感和耐药A2780细胞系对DDP的敏感性。既往研究证实,异丙酚可以通过调控miR-212-5p/TRPV6轴,影响卵巢癌细胞增殖迁移及侵袭过程,抑制卵巢癌转移[26]。由于加入异丙酚能够提高DDP耐药A2780细胞系的侵袭和潜移作用,因此对于异丙酚增加DDP敏感性具有一定说服力,异丙酚增加DDP敏感性从而发挥肿瘤治疗效果的途径之一是抑制肿瘤细胞恶性生物学行为。

裸鼠移植瘤实验结果显示,与Control组相比,异丙酚组和DDP组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积均明显下降,异丙酚+DDP组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积下降更明显,提示异丙酚和DDP能抑制体内肿瘤生长,而异丙酚进一步增强了DDP对体内肿瘤生长的抑制作用。

综上所述,本研究立足于探讨异丙酚干预对卵巢癌细胞进展的影响及异丙酚增加DDP敏感性的作用机制,从药物作用浓度、增加DDP细胞毒性作用、增加细胞凋亡率及抑制细胞侵袭几个方面进行阐述,揭示了异丙酚干预对卵巢癌细胞系A2780及耐药A2780细胞系的抑制作用。