泌淋清胶囊对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响*

秦川霞, 黎中恒, 黄磊, 饶青, 宋晶睿, 黄裕兵, 李艳梅***

(1.省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室 & 贵州医科大学 基础医学院 免疫教研室, 贵州 贵阳 550000; 2.贵阳市公共卫生救治中心 感染二科, 贵州 贵阳 550001)

白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病,因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍及凋亡受阻,而停滞在细胞发育的不同阶段,在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生累积,使正常造血受抑制并浸润其他器官和组织[1-2]。据2020年全球癌症统计报告,世界上每年至少有31万人因白血病死亡[3]。在恶性肿瘤所致的死亡率中,我国白血病居第9位,每年约6万余人因白血病而死亡,在儿童及35岁以下成人中居第1位[3-4]。目前白血病的治疗方法包括化疗、靶向治疗、免疫治疗及异基因造血干细胞移植等,但是治疗结果不容乐观,耐药、复发率高、副作用多、寻找供者难及费用高等,迫切需要更有效、毒副作用小及药物来源不受限的治疗药物[1]。近年来,中药被有效地用于治疗实体肿瘤,植物很可能是抗癌药物的来源之一[5],越来越多的研究证明了中药对癌症患者的疗效[6]。贵州是中药资源大省,现有中药材品种资源4 802种,占全国中药材种类总数的40%,居全国第2位[7]。据文献调研表明,国内外仅有少量的文献报道贵州民族药抗白血病活性的研究[8-9]。本研究旨在贵州民族药中寻找来源广泛、毒副作用小的抗白血病的天然药物。泌淋清胶囊(milinqing capsule,MLQ)是一种贵州民族药,中医认为其清热解毒、利尿通淋,用于湿热蕴结所致的小便不利,淋漓涩痛,尿血,急性非特异性尿路感染,前列腺炎见上述证候者[10]。MLQ主要成份包括四季红、黄柏、酢浆草、仙鹤草、白茅根及车前草6味中药材,其中黄柏、车前草为贵州地道药材[11]。黄连素(berberine,Ber)属于异喹啉类生物碱,可从黄连和黄柏中提取,用于治疗癌症、消化、代谢、心血管及神经系统疾病[12-17];车前草有降血脂、肝损伤保护、抗氧化、抗炎、降尿酸及造血等作用[18-22],但该药功能主治中无治疗白血病范畴,因此,本研究通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法、流式细胞仪测定MLQ对不同白血病细胞株增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞来源 人红白血病细胞HEL、人慢性髓系白血病细胞K562及人急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat均来自贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室液氮冻存。

1.1.2主要药物及试剂 MLQ(医联健康平台),RPMI 1640培养基(美国Hycone),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS;浙江天杭生物),MTT、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;北京索莱宝),细胞凋亡试剂盒(美国BD)。

1.1.3主要仪器 多功能酶标仪(美国Gene),流式细胞分析仪(美国艾森),A2型生物安全柜、离心机、细胞培养箱、超低温冰箱(美国Thermo),倒置荧光显微镜(德国Carl Zeiss),电子天平(美国METTLER TOLEDO),立式压力蒸汽灭菌器(上海申安)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养 从液氮罐取出HEL、K562及Jurkat细胞复苏,用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养液,5% CO2的37 ℃恒温培养箱中培养至对数增长期。

1.2.2MLQ样品的制备 按需称取适量MLQ药物(去除胶囊壳),按料液比1 g∶20 mL溶于60%乙醇溶液(另40%为ddH2O)中,充分混匀,摇床摇1 h,超声40 min,脱脂棉过滤2次;旋蒸仪旋蒸去除乙醇,-80 ℃过夜;冻干机去除水分,得粉末状样品;称量所得粉末状样品,将其配成100 g/L的MLQ母液(溶剂为10%DMSO溶液,另90%为ddH2O)备用。

1.2.3配制MTT溶液 称取MTT粉末0.5 g,加灭菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS )100 mL,配成5 g/L的MTT溶液,60 ℃溶解,0.22 μm过滤膜过滤除菌,分装,-20 ℃保存,4 ℃备用。

1.2.4配制三联液 称取十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)10 g,加少于95 mL的ddH2O使其充分溶解,加异丙醇5 mL后定容至100 mL,加盐酸100 μL。

1.2.5HEL细胞的MTT法测定 取对数增长期的HEL细胞(接种密度为8×103个/孔)接种于96孔板中,每孔 RPMI-1640培养基(含5% FBS)90 μL,培养4 h,每孔加不同浓度的MLQ 10 μL,使其终浓度分别为125、250及500 mg/L,每个浓度设4个复孔(记为实验组)和1个实验空白孔(实验空白孔仅有培养基和对应浓度的药物,未接种HEL细胞);另设对照组(加10%DMSO溶液10 μL),对照组设置4个复孔和1个对照空白孔(对照空白孔仅有培养基和10%DMSO溶液10 μL,未接种HEL细胞)。细胞置于37 ℃培养箱内开始计时,培养48 h;每孔加MTT溶液10 μL,培养4 h;每孔加三联液100 μL,37 ℃培养箱过夜;酶标仪测570 nm波长各孔的吸光度(absorbance,OD),计算存活率。

1.2.6K562 细胞的MTT法 取对数生长期的K562细胞(接种密度为8×103个/孔)接种于96孔板中,每孔 RPMI-1640培养基(含5% FBS)90 μL,培养4 h,每孔加不同浓度的MLQ 10 μL,使其终浓度分别为62.5、125.0、250.0 及500.0 mg/L,每个浓度设4个复孔(记为实验组)和1个实验空白孔(实验空白孔仅有培养基和对应浓度的药物,未接种K562细胞);另设对照组(加10%DMSO溶液10 μL),对照组设置4个复孔和1个对照空白孔(对照空白孔仅有培养基和10%DMSO溶液10 μL,未接种K562细胞)。细胞置于37 ℃培养箱,培养48 h;每孔加MTT溶液10 μL,培养4 h,每孔加三联液(SDS 10 g、异丙醇5 mL及盐酸100 μL,加ddH2O至终体积为100 mL)100 μL,37 ℃培养箱过夜;酶标仪测570 nm波长各孔的OD,计算存活率。

1.2.7Jurkat细胞的MTT法 取对数生长期的人白血病细胞Jurkat(接种密度为1×104个/孔)接种于4个96孔板中,每个96孔板进行如下处理:每孔加RPMI-1640培养基(含5% FBS)90 μL,培养4 h;加不同浓度MLQ 10 μL,使其终浓度分别为62.5、125.0及250.0 mg/L,每个浓度设4个复孔(记为实验组)和1个实验空白孔(实验空白孔仅有培养基和对应浓度的药物,未接种Jurkat细胞);另设对照组(加10%DMSO溶液10 μL),对照组设置4个复孔和1个对照空白孔(对照空白孔仅有培养基和10%DMSO溶液10 μL,未接种Jurkat细胞)。细胞置于37 ℃培养箱,4个96孔板分别培养24、48、72及96 h,于不同时间点的96孔板内每孔加 MTT溶液10 μL,培养4 h,每孔加三联液(SDS 10 g、异丙醇5 mL及盐酸100 μL混合,加ddH2O至终体积为100 mL)100 μL,37 ℃培养箱过夜;酶标仪测570 nm波长各孔的OD,计算存活率。

1.2.8流式细胞仪测定 取对数生长期的人白血病细胞Jurkat以5×105个/皿的接种密度接种于60 mm的圆形培养皿,每个培养皿加RPMI-1640培养基(含5% FBS)2 000 μL ,细胞培养箱中培养4 h,加不同浓度的MLQ,终浓度分别为150、300及600 mg/L;对照组加与600 mg/L浓度等量的溶剂(10%DMSO溶液),于5% CO2的37 ℃培养箱中培养,分别收集24 h和48 h的细胞,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)、Annexin V-FITC染色15 min,于流式细胞仪上测细胞凋亡并计算细胞凋亡率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HEL细胞存活率

由图1可见,125、250及500 mg/L MLQ作用于人红白血病细胞HEL 48 h,随着MLQ浓度的增加,HEL细胞存活率越低;与对照组相比,250 mg/L 及500 mg/L MLQ组人红白血病细胞HEL存活率均明显降低,差异有高度统计学意义(P<0.000 1)。

注:(1)与对照组比较,P<0.0001。图1 各浓度MLQ组人红白血病细胞HEL的存活率Fig.1 Survival rate of human erythroleukemia cell HEL at each concentration in MLQ group

2.2 K562细胞存活率

由图2可见,62.5、125.0、250.0及500.0 mg/L MLQ作用于人慢性髓系白血病细胞K562细胞48 h,随着MLQ浓度的增加,K562细胞的存活率越低;与对照组相比,125.0 mg/L、250.0 mg/L及500.0 mg/L MLQ组K562细胞存活率均明显降低,差异具有高度统计学意义(P<0.000 1)。

注:(1)与对照组比较,P<0.000 1。图2 各浓度MLQ组人慢性髓系白血病细胞K562的存活率Fig.2 Survival rate of human chronic myeloid leukemia cell K562 at each concentration in MLQ group

2.3 Jurkat细胞存活率

由图3可见,62.5、125.0及250.0 mg/L MLQ作用于人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞48 h,随着MLQ浓度的增加,Jurkat细胞的存活率越低;与对照组相比,62.5 mg/L MLQ组Jurkat细胞存活率降低,差异具有统计学意义(P<0.005);125.0 mg/L及250.0 mg/L MLQ组Jurkat细胞存活率均明显降低,差异具有高度统计学意义(P<0.000 1)。

注:与对照组比较,(1)P<0.005,(2)P<0.000 1。图3 各浓度MLQ组人急性淋巴细胞性白血病细胞Jurkat的存活率Fig.3 Survival rate of human acute lymphocytic leukemia cell Jurkat at each concentration in MLQ group

2.4 流式细胞术检测Jurkat细胞凋亡率

由图4可见,150、300及600 mg/L MLQ 作用于人急性淋巴细胞性白血病细胞Jurkat 24 h,随着MLQ浓度的增加,Jurkat细胞的凋亡率越高;与对照组相比,300 mg/L及600 mg/L MLQ组Jurkat细胞凋亡率均明显增高,差异有高度统计学意义(P<0.000 1);150、300及600 mg/L MLQ 作用于人急性淋巴细胞性白血病细胞Jurkat 48 h,随着MLQ浓度的增加,Jurkat细胞的凋亡率越高;与对照组相比,300 mg/L及600 mg/L MLQ组Jurkat细胞凋亡率均明显增高,差异有高度统计学意义(P<0.000 1),且与对照组相比,48 h比24 h的差异更明显。

注:A为凋亡率流式图(MLQ 作用于Jurkat细胞 24 h和48 h),B为凋亡率线图;(1)与同时间点对照组比较,P<0.000 1。图4 各浓度MLQ组Jurkat细胞24 h和48 h的细胞凋亡Fig.4 Jurkat cell apoptosis for 24 h and 48 h in MLQ groups

3 讨论

白血病临床表现与正常造血细胞生存受抑和白血病细胞增殖浸润有关;正常造血细胞生成受抑可引起感染、发热、出血和贫血;白血病细胞增殖浸润可导致肝、脾、淋巴结肿大及其他器官病变;症状的缓急主要取决于白血病细胞在体内的增长速率和积蓄程度[23]。白血病细胞通过对细胞凋亡的抵抗保持无限增殖,这些细胞可积聚在外周血、骨髓和淋巴器官中[24]。目前白血病的治疗结果并不容乐观。随着医药学的发展,天然药物在抑制肿瘤生长、增加化疗药物疗效或减轻化疗药物毒副反应方面的优势越来越受到研究者的重视[25-27]。中药(复方)由多个单方、多种化学成分组成,具有多成分、多效应、多靶点及多途径的特征[28]。随着中草药研究的发展,大量研究表明,中草药与化疗药物联合应用,可提高化疗药物的疗效[29-30]。中药的现代化研究是科学发展的必然过程。贵州省有中草药资源4 802种,其中药用植物4 419种,被列入国家重点保护的药用植物有28种,占全国58种的48.3%。贵州省中药材资源丰富、气候适宜、生态优良、民族医药积累丰富[7]。贵州民族药用于肿瘤辅助治疗已广泛应用于临床,且临床效果已得到充分肯定[31]。所以,本研究旨在从贵州民族药中寻找一种能抗白血病的天然药物。

本研究首先对民族药进行了醇提旋蒸冻干的处理,通过MTT法对3种不同类型的白血病细胞模型进行了细胞增殖的研究,结果表明MLQ对人红白血病细胞HEL、人慢性髓系白血病细胞K562以及人急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat的生长繁殖有显著的抑制作用,且随着MLQ浓度的增加,3种细胞的存活率均明显下降;MTT结果显示,与对照组相比,MLQ分别作用于3种细胞48 h,62.5 mg/L、125.0 mg/L MLQ组Jurkat细胞及125.0 mg/L MLQ组K562 细胞的增殖均受到明显的抑制(P<0.001);HEL、K562、Jurkat细胞代表了白血病的3种不同分型,MLQ在体外对这3种白血病细胞均有显著的抑制增殖的作用;由流式细胞术结果可以看出,无论是24 h还是48 h,与对照组相比,300及600 mg/L MLQ组Jurkat细胞发生凋亡,48 h差异更明显(P<0.001)。MLQ是已上市的贵州民族药,可直接应用于人体,且原材料丰富、来源不受限,因此具有很好的临床应用前景;本研究探讨了MLQ的新用途和新功效,其很可能成为抗白血病的新药,或从其中分离出能高效增敏的化合物。但是,目前对于MLQ抗白血病的机制还不够明确,本研究团队将对其作用机制进行系统、深入的探究。

综上所述,贵州民族药MLQ可以有效抑制不同类型白血病细胞的增殖并促进凋亡,尤其是对人红白血病细胞HEL、人慢性髓系白血病细胞K562以及人急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat,具有制备白血病细胞增殖抑制剂或防治白血病药物的潜在价值。