基于UGM靶标的贵州药用植物抗结核分枝杆菌化合物构建及类似物研究*

娄华勇, 傅建, 潘卫东*

(1.贵州省天然产物研究中心, 贵州 贵阳 550014; 2.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室, 贵州 贵阳 550014; 3.贵州中医药大学 药学院, 贵州 贵阳 550025)

结核病是我国乃至世界范围内严重危害人类健康的重大疾病之一[1],死亡人数居高不下[2-3]。多药、泛耐药或全耐药结核分枝杆菌菌株的迅速增加,加上结核病与艾滋病(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)并发感染等情况的出现,为本已严峻的结核病防控形势带来了新挑战[4-5]。具有全新作用机制及高效低毒的抗结核新药的研发将是解决这个问题的最佳途径之一[6-7]。细胞壁在结核分枝杆菌生存和增殖过程中起着至关重要的作用,二磷酸尿苷-半乳糖变异酶(uridine diphosphate galactopyranose mutase,UGM)是结核分枝杆菌细胞壁生物合成的关键酶之一,是已确证的抗结核药物新的理想靶标[8-11]。UGM是国际上公认的抗结核的重要靶标,除了参与结核分枝杆菌的繁殖,还参与多种真核和原核生物的生命代谢,包括多种寄生虫、锥虫及真菌等[12-13],并且是某些寄生虫、真菌的重要毒力因子[14-15]。因此,UGM是一个非常有潜力的全新药物靶标。但是当前UGM的分子反应机理尚未阐释清楚,且针对该酶的药物研发严重滞后。基于此,贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室潘卫东研究员项目团队另辟蹊径,探讨了天然药物分子与UGM的关系,构建了结构多样化的抗结核天然小分子化合物库,也报道了对天然来源UGM酶抑制剂的探索,并在后续研究过程中提出将动态组合化学方法应用于UGM抑制剂的筛选,实现了UGM抑制活性先导化合物的快速发现。

1 UGM分子探针的高效合成及其在探明UGM反应机理上的应用

因UGM天然底物及其类似物的合成难度非常大、稳定性差且难以分离纯化,不仅给UGM的分子作用机理及酶动力学研究带来困难,还严重制约了基于该酶靶标的抗结核新药研发进程。当前针对UGM的反应机理有2种主流猜想(图1A):一是通过打开异头碳处的吡喃环C-O键并经1,4脱水后形成过渡态中间体—1,4-环氧吡喃半乳糖,进而完成整个催化过程;二是通过形成黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)-亚胺离子中间体完成转化。为验证以上2种猜想,本研究团队根据推测的反应机理,设计并高效合成了一系列UGM天然底物—二磷酸尿苷-半乳呋喃糖(uridinediphosphate-galactofuranose,UDP-Galf)的类似物(图1B),同时进行了UGM抑制活性测试,深入探究了UGM的分子作用机理。其中化合物1(图1B)是本项目基于吡喃糖转化成呋喃糖过程中产生的高能量态中间体的可能结构合成的底物类似物[16],但是该化合物由于尿苷片段的缺失导致其抑制活性较弱,间接证明尿苷片段对于UGM抑制活性的重要性;后续合成的带有亲电性环氧乙烷片段的化合物2表现出与UGM较好的亲和力[17],进一步证实UGM催化过程中可能会形成半乳糖醇的推测,从而说明第2种猜想更为科学合理;此外,化合物3是本项目基于UGM催化过程中形成氧碳鎓离子的推测,设计、合成的含有2个吸电子基团的底物类似物[18]。以上分子探针的合成与相关活性研究,系统揭示了UGM的分子作用机理,为UGM分子机制、相关酶靶标模型构建及新型抑制剂开发奠定了良好的基础。

注:A为UGM参与半乳呋喃聚糖生物合成的2条可能途径,B为本团队设计合成的部分UGM探针分子。图1 UGM反应机理及探针分子Fig.1 The mechanism of UGM and their probes

2 基于贵州民族特色药用植物的抗结核分枝杆菌天然小分子化合物库的构建

潘卫东研究员项目团队先后完成了20余种贵州民族药用植物的系统分离纯化,从中获得了500余个天然产物,包括4个全新骨架和一系列新化合物。其中从唇形科(Labiatae)夏枯草属(Prunella)植物夏枯草(PrunellavulgarisLinn)的醇提物中分离得到化合物35个,包括4个新骨架化合物(Vulgarisins A～D,图2)和1个新化合物。Vulgarisins A～D是本团队发现的具有5/6/4/5四环母核结构的新骨架化合物[19-20],鉴于其特殊结构的复杂性,目前尚未见全合成的相关报道,进一步根据该类骨架结构的质谱裂解规律,从夏枯草石油醚部位获得了10个新骨架二萜化合物[21-22]。

图2 夏枯草中分离得到的新骨架二萜化合物Fig.2 Diterpenoids with novel skeleton from Prunella vulgaris

此外,还从夏枯草醇提物的乙酸乙酯部位获得了一个新颖的C21甾体洋地黄毒糖苷类化合物[23]。通过对菊科(Asteraceae)艾纳香属(Blumea)植物艾纳香(Blumeabalsamifera)醇提物的系统分离纯化,从其石油醚、乙酸乙酯等部位共获得单体化合物34个,包括15黄酮化合物和1个新化合物。除此之外,还从水龙骨科(Polypodiaceae)伏石蕨属(Lemmaphyllum)植物抱石莲[Lepidogrammitisdrymoglossoide(Bak.) Ching]、防己科(Menispermaceae)千金藤属(Stephania)植物黄叶地不容(Stephaniaviridiflavens)及百合科(Liliaceae)粉条儿菜属(Aletris)植物肺筋草[Aletrisspicata(Thunb). Franch.]等多种贵州特色民族药用植物的醇提物中获得了一系列天然产物或新化合物[24-25],为进一步开展基于UGM的活性测试及体外抗菌活性评价提供必要的物质基础。

3 先导化合物的发现及其结构衍生物的活性筛选

针对当前已报道的UGM抑制剂活性不高、成药潜质不足的问题,通过对前述天然小分子化合物库中的天然产物进行基于结核分枝杆菌UGM的抑制活性高通量筛选,发现来源于艾纳香的黄酮化合物槲皮素及木犀草素均显示出较好的UGM抑制活性[26]。进一步的细菌水平活性筛选结果显示,木犀草素具有较好的体外抗结核分枝杆菌活性,但其在抗结核分枝杆菌特异性上仍有明显的不足[26]。同时,分子对接结果也表明,其活性位点不在UGM的催化位点上,进一步通过酶动力学研究显示木犀草素可与UGM的变构位点结合(图3A和3B)[26]。Lineweaver-Burk双倒数图得到一组相交于X轴的直线(图3C),属于非竞争性抑制,证实了UGM存在第2个药物结合位点,为UGM的分子机制研究及相关药物开发开辟了新方向。为获得具有特异性的UGM抑制剂,本项目进一步通过对槲皮素及其类似物进行结构优化研究,完成了一系列黄酮类化合物的衍生合成,并对其进行了构效关系研究(图4)[27],为下一步的高活性新衍生物设计与合成奠定了坚实的基础。

图3 木犀草素与UGM分子对接结果及双倒数图Fig.3 Docking pose predicted for luteolin and Lineweaver-Burk plot

图4 黄酮类化合物UGM抑制活性的构效关系 Fig.4 The structure-effective relationship of flavone compounds inhibited UGM

此外,还发现来源于夏枯草的天然小分子化合物—迷迭香酸,虽然对结核分枝杆菌UGM只有中等水平的抑制活性[解离常数(dissociation constant,Kd)为500 μmol/L],但其对肺炎克雷伯氏菌UGM的抑制活性优异[平均Kd为(68.7±1.6)μmol/L],而且对结核分枝杆菌标准株H37Rv的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)也可达到50 mg/L,显示出作为抗结核分枝杆菌新药先导化合物的潜力[28]。为提升该先导化合物与UGM的结合能力及其成药性,本团队采用计算机辅助药物设计等方法,通过酯化、分子缩合、水解以及还原等方法[29],对迷迭香酸类天然先导物进行了结构改造,获得64个具有酰胺类、磺酰胺类以及酯类等母核骨架的结构衍生物(图5)。进一步的抗结核活性筛选结果显示,11个结构衍生物在终浓度为1 mmol/L时对MtUGM的抑制率均为40%以上,其中,活性最好的化合物4抑制率达81.54%,其Kd值为63 μmol/L左右(图6),表现出与阳性对照UDP(抑制率为86.4%)相当的UGM抑制活性[29]。与此同时,该研究团队通过生物电子等排策略设计的烯酰胺类化合物抑制UGM活性比第一代化合物提高了近10倍[30]。总之,通过该方向的研究,扩充了UGM抑制剂的结构类型,也为后续新药候选分子的发现提供较好的科学基础。

图5 迷迭香酸结构衍生物的设计合成Fig.5 Design and synthesis of rosmarinic acid derivatives

图6 通过动态组合化学发现的全新UGM酶抑制剂Fig.6 Novel UGM enzyme inhibitors discovered by dynamic combinatorial chemistry method

4 基于动态组合化学方法的UGM抑制剂快速发现策略

动态组合化学作为一种非经典的化学合成方法,系由诺贝尔化学奖得主—法国科学家Jean-Marie Lehn于上世纪末提出,并逐渐应用于药物化学、材料学等领域[31-33]。本团队将动态组合化学方法引入UGM抑制剂的设计与合成中,并发现了一类具有全新结构类型的UGM抑制剂(图6,H3+A1化合物),针对MtUGM的抑制活性比先导化合物4和5提高了近300倍,这也是目前报道活性最好的UGM酶抑制剂,文章在Chem.Commum.一经发表就被遴选为该期封面文章[34]。该法有效地建立了化学合成和生物评价之间的联系,极大缩短了抗结核分子杆菌新药苗头化合物的发现时间;本项目的相关研究结果也拓宽了动态组合化学的应用范围,并为基于其他药物靶标抑制剂的快速发现提供了借鉴。

综上,本研究团队在抗结核分枝杆菌细胞壁生物合成关键酶UGM的分子作用机理、天然抑制剂发现及其衍生物设计合成等研究领域取得了一系列原创性、标志性成果,探明了UGM反应机理,构建了贵州民族特色药用植物的抗结核分枝杆菌天然小分子化合物库,并发现了天然产物来源的UGM抑制剂,从而解决了UGM研究领域的一些关键科学问题,如UGM抑制剂成药性不佳的瓶颈、UGM变构位点的发现等等;“基于UGM新靶标的抗结核分枝杆菌天然化合物及其类似物研究”项目荣获2020年度贵州省自然科学奖二等奖;项目的实施为贵州省培养了一批具有较高水平的抗结核分枝杆菌新药研发的基础研究专业人才,建立了较为系统的研究体系,可为研究与开发基于新靶标的抗结核分枝杆菌药物提供了技术支持,促进了贵州省在中药民族药物创新研究领域的跨越式发展。