外泌体非编码RNA在腹主动脉瘤患者中的表达及其临床意义

李闯,秦翠杰,罗云鹏,李震,曹辉

(郑州大学第一附属医院 腔内血管外科,河南 郑州 450052)

腹主动脉瘤因其较高的死亡率引起了人们广泛的关注,然而,腹主动脉瘤研究进展的确切分子机制尚不清楚。因此,明确腹主动脉瘤患者发生及进展的病因机制,在腹主动脉瘤的诊断、治疗和预后提供新的靶点等方面具有重要意义。近年来,人们发现外泌体在信号转导和内环境的调节中起着重要的作用,其对受体细胞的生物学效应取决于外泌体的组成和受体细胞的微环境组成,但参与其形成和分泌的机制才刚刚开始被阐明[1]。研究发现,非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNA)在许多人类疾病的发展中起着重要作用,并可能作为疾病和药物治疗的潜在生物标志物[2]。因此,明确外泌体ncRNA在腹主动脉瘤发生发展中的作用,对于腹主动脉瘤的预防、诊断以及治疗具有重要的临床意义。

1 资料与方法

1.1 样品采集3例腹主动脉瘤患者和3例健康人的血浆样本由郑州大学第一附属医院提供。本研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准,并获得了所有参与者的知情同意。所有腹主动脉瘤患者均经主动脉全程CTA进行影像学确诊,腹主动脉直径均>50 mm。选择健康人作为对照组,将血液收集到EDTA抗凝血管中。

1.2 外泌体的分离和鉴定LX-2细胞在含有10%外泌体耗尽的胎牛血清的DMEM中培养。外泌体使用RiboTM外泌体分离试剂(细胞培养基)(RiboBio,广州,中国)提取。外泌体的大小应用电镜进行了测试(图1A)。使用RiboTM外泌体分离试剂从血浆中分离外泌体(CAT.NO.C101102,Ribobio,中国)。首先将血浆样品在室温下以2 000g离心20 min,以消除任何剩余的细小细胞或碎片,然后将上清液转移到1个新的试管,在室温下以10 000g离心20 min。将上清液转移到1个新鲜的试管中,用3体积的一冲程分离剂处理。在4 ℃下30 min后,将混合物在4 ℃下以15 000g离心2 min。在去除上清液后,用磷酸盐缓冲盐水对外分泌物进行复苏。用ZETASIZER Nano系列电镜(Malvern, England)测量外泌体的大小。

1.3 提取外泌体中的ncRNA使用Trizol从外泌体中提取总RNA。根据NEBNext®超TMRNA制备试剂盒(NEB,美国)的说明,对片段RNA(进行第1链和第2链cDNA合成。使用安捷伦2200和Qubit®2.0对纯化后的产品进行了评估。使用aHiSeq3000平台进行配对测序(PE150,测序长度为150 bp)。

1.4 测序reads的预处理/质量控制原始的fastq序列用修剪工具(v0.36)处理,使用以下选项:尾随20,MINLEN 235和CROP 235,以删除低于质量分数20的尾随序列,并为下游聚类过程实现统一的序列长度。使用FastQC软件检测测序读取质量。测序reads从末端进行裁剪(碱基质量<20),并按长度(<25)进行过滤。

1.5 基因表达水平的定量分析用HISAT2将配对的末端序列与小鼠参考基因组对齐。HTSeq v0.6.0用于计算每个基因的reads数。整个样本的表达水平以RPKM(每百万碱基对测序的转录本序列的预期读数/千碱基数)表示,这是推荐的和最常用的估计基因表达水平的方法。

1.6 基因差异表达分析使用DEGseq软件,通过调整后的P值阈值为<0.05和|log2(折叠变化)|>1,获得差异有统计学意义的差异基因。最后,利用R语言包gplot对不同组中差异基因的RPKM值进行层次聚类分析。而颜色代表不同的聚类信息,如在同一组中相似的表达模式,包括相似的功能或参与相同的生物过程。

1.7 GO和KEGG途径富集分析选择所有差异表达的ncRNA用于GO和KEGG通路分析。GO采用KOBAS3.0软件进行。GO提供了基因功能和基因产物属性(http://www.geneontology.org)的标签分类。生物通路与基因本体论分析包括3个领域:细胞成分、分子功能和生物过程。利用KOBAS3.0软件(http://www.genome.jp/kegg)对KEGG通路中差异表达的ncRNA和不同通路的富集情况进行了定位。

2 结果

采用DEGseq筛选了621种差异表达的ncRNA,其中460种上调,161种下调(图1B),热图显示了6个样本之间的基因表达差异(图1C),火山图显示有631种ncRNA存在显著表达差异,本研究选择了患者与正常健康人差异较大的20种ncRNA列入表中,其中上调和下调各为10种,表达上调的ncRNA包括MIR1539、MIR3674、SNORD115-47、MIR3188、MIR4443、microRNA 7641-1、MIR4262、SNORD115-18、MIR5096、MIR557;表达下调的ncRNA包括SCARNA13、SNORA11、SNORD3A、RNU4-1、RMRP、RNU4-2、MALAT1、NR144567.1、TALAM1、SNORA73B。

KEGG分析显示,与这些基因相关的通路,即内质网中的代谢通路、钙信号通路和蛋白调控通路(图1D),特别是代谢通路最为显著(图1D)。GO生物分析由3个独立的本体组成:生物过程、分子功能和细胞成分。通过对不同功能基因的分类,进行了基因注释和功能富集分析。生物过程的结果表明,靶基因参与了生物调控和代谢的过程。细胞成分富集的结果显示,靶基因在细胞内的细胞器和与细胞膜结合的细胞器中均显著富集(图1E)。

A为经电镜确定成功提取了外泌体;B筛选了621种差异表达的ncRNA,其中460种上调,161种下调;C热图显示了6个样本之间的基因表达差异;D为KEGG分析;E为GO分析。

3 讨论

腹主动脉瘤的定义是腹主动脉局部扩张,超过正常直径50%,或以主动脉直径超过30 mm,是中老年人发病和死亡的最重要原因之一[3]。腹主动脉瘤危险因素包括吸烟、高血压、高胆固醇血症、冠心病和外周动脉闭塞性疾病、高龄、男性和类似疾病家族史,有趣的是,糖尿病患者的风险较低[3]。腹主动脉瘤在男性中的发病率为4%～7%,在65岁以下的女性中为1%～2%[4]。腹主动脉瘤的自然病程是渐进的,有潜在致命破裂的风险。如果不治疗,腹主动脉瘤破裂死亡率高达97.2%[4]。腹主动脉瘤病理特征包括血管平滑肌细胞凋亡、炎症细胞浸润,失去动脉壁完整性,增加氧化应激和显著退化和主动脉壁变薄引起的血管平滑肌细胞凋亡[5]。由于腹主动脉破裂可导致较高的死亡率。因此,探索腹主动脉瘤的分子机制,提高腹主动脉瘤患者的诊断与治疗水平就显得尤为迫切。

外泌体已被证明参与各种病理生理活动,在动脉粥样硬化病理生理过程中,外泌体可调节内皮细胞炎症的进程,促进血管平滑肌细胞的分化,并诱导巨噬细胞凋亡,另一方面,巨噬细胞衍生的外泌体可通过诱导白细胞黏附而加重内皮炎症[5]。外泌体在动脉粥样硬化进展中可调节胞间通讯[6]。近年来,越来越多的ncRNAs被发现参与血管病变的进程。从整体上看,血管平滑肌细胞凋亡过程中ncRNA表达有上调也有下调,但其功能表达变化所造成的影响是否具有选择性及表达改变的上下游机制有待阐明。目前关于ncRNAs参与血管平滑肌细胞凋亡的研究尚处于起步阶段,相关的研究报道不多,涉及的机制也很单一,发现更多参与血管平滑肌细胞凋亡的ncRNAs并阐明其发挥作用的上、下游机制将是未来研究的方向。

到目前为止,已有多种ncRNAs被报道参与调控腹主动脉瘤的发展。本研究筛选了621种差异表达的ncRNA,其中460种上调,161种下调,选取了上调下调差异最为显著的ncRNA各10个进行阐述。表达上调的ncRNA包括MIR1539、MIR3674、SNORD115-47、MIR3188、MIR4443、microRNA 7641-1、MIR4262、SNORD115-18、MIR5096、MIR557;表达下调的ncRNA包括SCARNA13、SNORA11、SNORD3A、RNU4-1、RMRP、RNU4-2、MALAT1、NR144567.1、TALAM1、SNORA73B。这些ncRNA可能影响腹主动脉瘤的发生和发展。

外泌体来源的MIR1539在结直肠癌患者中显著上调[7]。ncRNA RP11-81H3.2可通过调节MIR1539/COL2A1抑制细胞凋亡,从而抑制椎间盘退行性变的进程[8]。MIR3188通过mTOR-p-PI1K/AKT-c-JUN的FOXO3调制正反馈环来调节鼻咽癌增殖和化学敏感性[9]。其次,它通过靶向调节肝细胞癌细胞的增殖和凋亡[10]。癌症相关成纤维细胞中外泌体miR-3188的缺失有助于头颈癌的进展[11]。MiR-3188通过FOXO1介导的mTOR-p-PI3K/AKT-c-JUN信号通路抑制非小细胞肺癌细胞增殖[12-13],通过靶向TUSC5和调节p38 MAPK信号通路来调节乳腺癌的细胞增殖、凋亡和迁移,可增强乳腺癌细胞对电离辐射的敏感性[14]。与本研究相关的是MIR3188参与RhoA/ROCK途径以调节动脉粥样硬化的发展[15]。MIR4443在多种癌症中表达差异显著,如乳腺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤和头颈部鳞状细胞。此外MIR4443在非肿瘤疾病中也存在异常表达,例如血浆中MIR4443表达的上调与急性缺血性卒中的风险有关,而血浆中MIR4443表达的下调是心房颤动的危险因素[16]。MIR7641可作为膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌和胃癌患者诊断的生物标志物[17]。血管紧张素转换酶通过抑制MIR4262的表达从而抑制急性肺损伤期间肺内皮细胞的凋亡[18],通过直接靶向KLF6和KLF15促进人类乳腺癌细胞的增殖和侵袭[19],通过靶向SIRT1和激活骨关节炎大鼠的PI3K/AKT/mTOR信号通路来调节软骨细胞活力、凋亡,自噬[20],通过KLF6介导的EGFR失活和p21上调促进人皮肤恶性黑色素瘤细胞的增殖[21]。MIR-5096可影响人乳腺癌细胞中的铁死亡和抗肿瘤作用[22]。

相关研究通过生物信息学方法鉴定关键snoRNA11可作为肝细胞癌的生物标志物[23]。SNORD3A-尿苷单磷酸合成酶轴可提高基于5-氟尿嘧啶的化疗对乳腺癌患者的疗效[24]。RMRP通过miR-206促进膀胱癌的增殖、迁移和侵袭[25]。M6A RNA甲基化介导的RMRP稳定性通过调节TGFBR1/SMAD2 /SMAD3途径使非小细胞肺癌的增殖和进展[26]。此外RMRP与胆管癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌和冠状动脉粥样硬化患者中表达上调[27]。MALAT1的诊断和预后意义已在乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胆囊癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、神经胶质瘤癌、肝细胞癌和多发性骨髓瘤中得到证实。MALAT1通过调节miR-150-5p/AKT3轴促进骨关节炎[28]。MALAT1的表达下调可促进动脉粥样硬化[29]。

外分泌ncRNA在体内扮演着重要的作用,在腹主动脉瘤的发生和发展中可能起着重要的作用,可能作为腹主动脉瘤的生物标志物。但由于本研究不深入,样本数量较少,结果较为表浅,下一阶段的工作是进一步深入和具体地研究某一个ncRNA的作用机制,以达到临床应用的目的。

综上,外泌体ncRNA在正常人和腹主动脉瘤患者之间的表达存在差异。这些ncRNA可能通过激活代谢通路和钙信号通路进行调控,导致血管平滑肌功能障碍和血管结构异常,进而影响腹主动脉的发生和发展,可能成为腹主动脉瘤新型的生物标志物。