支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表达水平联合检测对非小细胞肺癌的诊断价值

江林燕 王向迎 韩利娜

肺癌是全球最常见的癌症之一[1],相当多的肺癌患者被确诊时已处于晚期,晚期患者的5年生存率约为15%[2]。早期检测肺癌的方法有侵入性和非侵入性的,包括荧光支气管镜检查、痰细胞学检查和胸部X线检查[3],但是,特异性或敏感性较低。目前,使用血液,尿液和唾液等体液进行生物标志物检测已成为癌症诊断和治疗监测的一种有前途的方法,这主要是因为其侵入性最小且易于获取[4]。目前发现支气管肺泡灌洗液(BALF)中的生物大分子可作为肺癌的生物标志物[5]。BALF是在常规的柔性支气管镜检查期间收集的,已被广泛接受为一种安全且微创的方法[6]。BALF的优点在于它可以提供多种信息,包括发生在肺实质中的免疫、炎症和感染过程[7]。Uribarri M等[8]通过二维电泳后质谱分析鉴定了非小细胞肺癌支气管肺泡灌洗液中的潜在标志物:载脂蛋白A1(Apolipoprotein A1,APOA1)、补体成分4A (Complement Component 4A,CO4A)、C反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP)。然而,除了二维电泳方法复杂繁琐外,这些潜在标志物并未在临床中进行验证和分析其诊断价值。基于此,本研究将支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP单项诊断效能进行比较,旨在探讨联合诊断对非小细胞肺癌的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

纳入2017年8月至2020年8月我院收治的非小细胞肺癌患者92例为癌症组,其中男性62例、女性30例,平均年龄(54.35±16.43)岁。所有患者先前均已通过对从原发灶获取的活检样品进行组织病理学分析而诊断为非小细胞肺癌,并依据肺薄层CT影像学记录肿瘤最大直径。排除标准:①严重心、肝、肾功能损害者;②服用过内分泌药物者;③患有其他肿瘤者;④患有精神疾病者;⑤进行过相关治疗者。纳入肺炎患者30例为肺炎组,其中男性15例,女性15例,平均年龄(52.45±12.42)岁。纳入支气管炎患者30例为支气管炎组,其中男性14例,女性16例,平均年龄(53.55±13.35)岁。纳入肺结节患者30例为肺结节组,其中男性17例,女性13例,平均年龄(54.96±15.37)岁。同时,纳入2017年8月至2020年8月至我院进行体检的健康志愿者92例为对照组,其中男性56例,女性36例,平均年龄(57.32±17.12)岁。良性组和对照组合并为非癌症组。各组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05),可纳入此次分析。本研究经医院伦理委员会审批,受试者均签署知情同意书。

1.2 酶联免疫吸附实验

从5组受试人员的节段性支气管中收集20 ml支气管肺泡灌洗液,在4 ℃下以500 g离心5 min以除去碎屑,使用Amicon过滤器以5000 g在4 ℃下浓缩60 min,使用0.5 mL 3 kDa Amicon过滤器浓缩蛋白质样。通过Bradford测定法测量每种BAL的总蛋白浓度,将所有样品的蛋白浓度归一化为5 μg/μL。采取5组受试人员肘前静脉血5 ml,在4 ℃静止过夜后以500 g离心5 min取上清为血清。APOA1 ELISA试剂盒购自北京欣博盛生物科技有限公司(货号:EHC121.96.2)。CO4A ELISA试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司(货号:ADI-900-059)。CRP ELISA试剂盒购自广州威佳科技有限公司(货号:ELH-CRP-2(2x96T))。CA125 ELISA试剂盒购自上海群己生物科技有限公司(货号:KA0205)。

1.3 统计学分析

使用Python中pandas package进行统计学分析。阳性临界值为ROC曲线中灵敏度-(1-特异度)的最大值所对应的数值。患有非小细胞肺癌的为真阳性,未患有非小细胞肺癌的为真阴性。三者满足其一者为联合诊断阳性,反之则为联合诊断阴性。使用one-way ANOVA检验检测5组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP表达水平的差异性。应用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP检测非小细胞肺癌的临床诊断价值。Pearson相关系数检测支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP与肿瘤直径大小的相关性。P<0.05的差异被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 5组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表达水平

癌症组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表达水平均高于肺炎组、支气管炎组、肺结节组和对照组受试人员(P<0.05),肺炎组、支气管炎和肺结节组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表达水平均高于对照组受试人员(P<0.05)。肺炎组、支气管炎和肺结节组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表达水平无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 5组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表达水平

2.2 癌症组和非癌症组支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的ROC曲线、AUC、灵敏度、特异度和截断值

为了评估支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125对非小细胞肺癌的诊断价值,绘制相关ROC曲线(图1)。APOA1的阳性临界值128.5(ng/ml)时诊断灵敏度为91.05%,特异度为91.14%;CO4A的阳性临界值20.97(ng/ml)时诊断灵敏度为90.35%,特异度为91.22%;CRP的阳性临界值90.51(ng/ml)时诊断灵敏度为92.45%,特异度为93.06%。见图1和表2。以APOA1、CO4A、CRP的阳性临界值为诊断标准进行联合诊断。支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP联合对非小细胞肺癌的诊断的灵敏度为98.91%,特异度为90.22%,准确性为93.12%。CA125的阳性临界值11.51(U/ml)时诊断灵敏度为83.04%,特异度为85.24%。

图1 癌症组和非癌症组支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的ROC曲线

表2 癌症组和非癌症组支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的AUC、灵敏度、特异度和截断值

2.3 支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表达水平与非小细胞肺癌肿瘤大小的相关性

支气管肺泡灌洗液中APOA1的表达水平与非小细胞肺癌肿瘤大小的相关系数为0.314(P<0.05);支气管肺泡灌洗液中CO4A的表达水平与非小细胞肺癌大小的相关系数为0.225(P<0.05);支气管肺泡灌洗液中CRP的表达水平与非小细胞肺癌大小的相关系数为0.284(P<0.05)。见图2。

图2 支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表达水平与非小细胞肺癌大小的相关性

3 讨论

肺癌仍然是世界范围内与癌症相关的死亡的最常见原因[9]。NSCLC通常通过外科手术治疗,而SCLC通常对化学疗法和放射疗法的反应更好[10]。但是,传统疗法的临床结果仍然很差(5年生存率为15%),这主要是由于难以早期诊断。本研究通过ELISA检测,发现支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP联合检测对非小细胞肺癌的诊断的灵敏度为98.91%,特异度为90.22%,准确性为93.12%。

支气管镜检查可被视为疑似肺癌患者的主要诊断方法,也是选择适当治疗策略的必要方法[11]。尽管其他组织采购方法具有较小的侵入性,但并发症风险小且特异性高,尽管它的敏感性相对较差。预计不需要收集肿瘤细胞的方法,例如支气管液中分子标记的检测,将提高细胞学检查的敏感性和诊断准确性[12]。传统上,血液一直是用于非侵入性生物标志物分析的生物流体,但是在这种复杂混合物中检测低丰度肿瘤蛋白可能非常具有挑战性。与活检相比,支气管肺泡灌洗代表着更特异性的肺癌生物标志物的替代来源,因为它靠近肿瘤细胞,其蛋白质组成较不复杂,并且可以通过微创方法获得[13]。因此,相比于传统方法,支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表达水平检测对于诊断非小细胞肺癌具有高灵敏性和高特异性。

在本研究中,癌症组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表达水平均高于肺炎组、支气管炎组、肺结节组和对照组受试人员(P<0.05),肺炎组、支气管炎和肺结节组受试人员支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP以及血清中CA125的表达水平均高于对照组受试人员(P<0.05)。CO4A是经典激活途径的一部分。补体系统既参与先天免疫,也参与适应性免疫,是机体免疫系统的一个非常重要的部分[14]。CRP通过与血液中的体液和细胞效应系统相互作用来识别宿主的外来病原体和受损细胞,并启动其清除,从而参与多种宿主防御相关功能[15]。目前,已有文献报道肺癌患者中CRP和CO4A补体因子过表达。提示慢性活动性炎症状态和免疫应答异常是非小细胞肺癌的标志之一。APOA1调节高密度脂蛋白的形成和脂蛋白脂肪酶的活性[16],提示血脂异常和代谢紊乱可能与非小细胞肺癌的发生发展相关。肥胖、脂质和非小细胞肺癌风险之间的关系已经得到了大量的科学统计分析,肥胖可能是肺癌发生的一个预防因素。提示APOA1表达量的提高可能是机体为了抵抗非小细胞肺癌而启动的一种防御机制。

然而,本研究存在一些局限性。首先,患者人数相对较少,这导致了小组人数的减少,需要对更多患者进行进一步研究以证实我们的发现。其次,本研究没有考虑与肺部病原体感染的可能性。此外,多项研究发现肺癌与吸烟习惯有关[17],但是本研究尚未将患者是否吸烟进行分组。

综上所述,支气管肺泡灌洗液中APOA1、CO4A、CRP的表达水平可作为非小细胞肺癌的潜在标志。