HPLC法测定湘产枳壳炮制前后10种化学成分的含量*

段妍琴，刘胜兰，刘瑞连，屈彬清，谭电波，刘春海，刘东亮

（1.湖南师范大学附属长沙医院/长沙市第四医院，湖南 长沙 410006；2.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；3.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208；4.湖南省中医药研究院中医基础研究所，湖南 长沙 410006）

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实，具有理气宽中、行滞消胀的功效[1]。现代药理研究表明，枳壳具有调节胃肠蠕动、抗菌、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、保肝、抗休克等作用[2-3]。枳壳主要成分包括黄酮类、香豆素类、挥发油和生物碱类等[4-6]。黄酮类化合物为枳壳主要有效成分，包括柚皮苷、新橙皮苷等，具有抗菌、抗病毒、抑制毛细血管脆性等多种生物活性[7-10]。香豆素类成分以橙皮内酯为代表，对调节胃肠运动的乙酰胆碱酯酶有明显抑制作用[11]。挥发油中以柠檬酸为主要成分[12]，可发挥升血压、调节胃肠运动、扩张气管等作用[13]。枳壳是常见的调节内脏功能的药食两用药材，在中国、日本、韩国等亚洲地区临床应用广泛[14-15]。

枳壳炮制历史悠久，生品燥性较强[16-17]，其醋制能引药入肝，增强散瘀止痛、开胃养肝的功效[18]；麸炒具有去燥和胃的作用[19]；盐制后能增强一些药物的溶解度，引起盐炙前后药效和吸收代谢的变化[20]。中药炮制后临床疗效会发生变化，但目前关于枳壳炮制前后化学成分变化的研究还不够全面，多见麸炒品炮制前后研究[21-23]，对枳壳醋制、盐制及水润的研究较少，在一定程度上限制了其炮制品的推广应用[24-26]。

2020年版《中华人民共和国药典》仅以同时测定柚皮苷和新橙皮苷两个黄酮类化合物的含量来控制枳壳的质量，不能反映炮制前后质量的全貌。因此，本研究选择枳壳中8种主要黄酮类成分（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、桔皮素、川陈皮素、枸橘苷、甜橙黄酮）和2种主要香豆素类成分（橙皮内酯和橙皮油素），建立一个合理而有效的多成分含量分析方法，测定枳壳炮制前后（生品、麸炒、醋炙、水润、盐炙）成分含量的变化，旨在为枳壳及其炮制品质量评价提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；XS205DU十万分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）；CP224C型分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；KQ5200DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Millipore S.A.S.67120 Moisheim超纯水系统。

1.2 试药 芸香柚皮苷对照品（批号：MUST-16030408）购于成都曼斯特生物科技有限公司；柚皮苷对照品（批号：10552-201301）、橙皮苷对照品（批号：10089-201203）、新橙皮苷对照品（批号：10477-201203）均购于南昌贝塔生物科技有限公司；橙皮内酯（批号：23971-42-8）、枸橘苷对照品（批号：14941-08-3）、甜橙黄酮对照品（批号：2306-27-6）、川陈皮素对照品（批号：MUST-16070901）、桔皮素对照品（批号：481-53-8）、橙皮油素（批号：495-02-3）均购于宝鸡市辰光生物科技有限公司，以上试药质量分数均≥98%；色谱纯乙腈、甲醇均购于德国默克股份有限公司；磷酸为分析纯，水为超纯水。枳壳药材由湖南中医药大学中药鉴定教研室龚力民老师鉴定为正品，均为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。（见表1）

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，82%A →75%A；15 ～40 min，75%A →40%A；40 ～50 min，40%A→5%A；50～60 min，5%A；60～60.1 min，5%A→82%A），流速：1.0 mL/min；变换波长检测：0～5 min，318 nm；5～19 min，300 nm；19～21 min，320 nm；21～31 min，285 nm；31～60 min，324 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素和橙皮油素对照品适量，分别加甲醇稀释成含芸香柚皮苷100.00 μg/mL、柚皮苷420.00 μg/mL、橙皮苷32.12 μg/mL、新橙皮苷260.00μg/mL、橙皮内酯42.75μg/mL、枸橘苷52.50 μg/mL、甜橙黄酮26.00 μg/mL、川陈皮素32.00 μg/mL、桔皮素31.50 μg/mL和橙皮油素25.20 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 枳壳炮制品的制备

2.3.1 生品 随机取枳壳原药材样品（湖南安仁、湖南石门），参考2020年版《中华人民共和国药典》枳壳饮片的炮制要求，除去杂质，洗净，润透，切薄片（1～2mm），干燥后筛去碎落的瓤核。

2.3.2 麸炒 先用中火将锅预热，将麦麸均匀撒入锅中，待冒出大量浓烟时，随即投入枳壳片（“2.3.1”项生品炮制饮片），迅速翻动，炒至枳壳表面呈艳黄色时迅速出锅，取出，筛去麸皮，放凉。每100 g枳壳用麦麸10 g。

2.3.3 醋炙 随机取枳壳片（“2.3.1”项生品炮制饮片），加米醋拌匀，闷透，至醋被吸尽，置炒制容器内（药量不超过锅高度的2/3），用文火（小火）加热，采用八字法翻炒，炒至药物近干时出锅，取出，放凉。每100 g枳壳用陈醋30 g。

2.3.4 水润 称取石门枳壳原药材300 g，水喷洒枳壳原药材，盖上保鲜膜，润15 h。将水润的石门枳壳切成1～2 mm薄片，置于40 ℃的烘箱内干燥10 h，干燥后筛去碎落的瓤核。

2.3.5 盐炙 随机取枳壳片（“2.3.1”项生品炮制饮片），加盐水闷12 h，切1 mm厚的片，置于锅内，采用八字法翻炒，炒至药物近干时出锅，取出，放凉。每100 g枳壳用食盐1 g，水适量（一般为盐的4～5倍）。

2.4 供试品溶液制备 精密称取枳壳粗粉（过二号筛）与其炮制品各0.5 g（药材信息见表2），将其置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL，精密称定，超声提取45 min，取出，放凉，称质量，用甲醇补齐质量，摇匀，过0.45μm滤膜，取其续滤液，即得。

表2 药材信息表

2.5 专属性试验 按照“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液进行测定。结果见图1。由图可知，各成分色谱峰分离度理想，理论塔板数均＞5 000，分离度均＞1.5，显示了良好的专属性。

图1 混合对照品溶液（A）、供试品溶液（B）的HPLC 图

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系的考察 分别精密称取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素和橙皮油素对照品溶液适量，加入甲醇进行稀释，得到一系列不同质量浓度的混合对照品溶液。将上述不同质量浓度的混合对照品溶液按“2.1”项下色谱条件下进样，以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 10 种成分的回归方程及线性范围

2.6.2 精密度试验 取同一混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素和橙皮油素峰面积的RSD值（n=6）分别为1.39%、1.40%、1.36%、1.42%、1.42%、1.29%、1.09%、1.04%、1.05%、0.71%，均＜3%，结果仪器显示精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 分别精密吸取同一供试品溶液10 μL（S1：湖南安仁），按“2.1”项下色谱条件，于0、1、2、4、8、24 h进样测定，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素和橙皮油素峰面积RSD值分别为2.33%、2.29%、1.04%、2.48%、2.57%、2.75%、1.81%、2.52%、2.44%、1.34%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.4 重复性试验 取同一样品6份（S1：湖南安仁），按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮内酯、枸橘苷、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素和橙皮油素的含量RSD值分别为1.75%、1.81%、2.19%、2.06%、2.42%、2.12%、2.26%、2.43%、2.73%、1.66%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 精密称取已知含量药材6份（S1：湖南安仁），每份0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入各对照品溶液适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进行测定，计算平均加样回收率和RSD值。（见表4）

表4 各成分加样回收率试验结果 （n=6）

2.7 样品含量测定 取已制备好的7份供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，并根据外标法计算含量，结果见表5～7。对比情况见图2～4。由表7与图2可知，枳壳经麸炒后，主要成分含量显著增加；采用不同辅料炮制时，化学成分变化差异较大。芸香柚皮苷的含量变化是：水润＞盐炙＞麸炒＞醋炙＞生品；柚皮苷的含量变化是：水润＞盐炙＞麸炒＞醋炙＞生品；橙皮苷的含量变化是：水润＞麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品；新橙皮苷的含量变化是：水润＞麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品；枸橘苷的含量变化是：水润＞麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品；橙皮内酯的含量变化是：麸炒＞盐炙=醋炙＞生品＞水润；甜橙黄酮的含量变化是：麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品=水润；川陈皮素的含量变化是：麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品＞水润；桔皮素的含量变化是：麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品＞水润；橙皮油素的含量变化是：麸炒＞盐炙=醋炙＞生品＞水润。

图2 不同炮制品枳壳（湖南安仁）中主要成分含量柱状图

图3 不同炮制品枳壳（湖南石门）中主要成分含量柱状图

图4 不同炮制品枳壳中黄酮类成分含量3D 柱状图

表5 不同炮制方法的枳壳药材中主要成分含量测定结果 （mg/g）

表6 不同炮制品枳壳（湖南安仁）中主要成分含量 （%）

表7 不同炮制品枳壳（湖南石门）中主要成分含量 （%）

3 讨论

3.1 提取时间选择 本研究考察了不同提取时间对提取效率的影响。结果发现，超声提取45 min时，样品中各成分的含量提取完全，延长提取时间，没有显著提高成分的提取量，因此采用超声提取45 min的方法制备供试品溶液。

3.2 色谱条件选择 本研究分别将10种对照品溶液于紫外检测器下进行波长扫描，检测其最大吸收波长，确定了变换波长检测的方法，并且对供试品提取时间及色谱条件柱温和流速进行了优化，确定了本研究的色谱条件。

4 结论

2020年版《中华人民共和国药典》一部规定枳壳中含柚皮苷不得少于4.0%，新橙皮苷不得少于3.0%。本研究中所有样品均符合药典标准。本研究对枳壳饮片采用不同炮制方法，对其主要黄酮类成分的含量进行研究，结果表明，炮制品中黄酮类成分的含量大多较生品含量高，其中，比较不同炮制方式对各成分的影响，烘制＞炒制，比较辅料对各成分的影响时芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷的含量变化通常是：水润＞麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品；而橙皮内酯、甜橙黄酮、川陈皮素、桔皮素、橙皮油素的含量变化通常为：麸炒＞盐炙=醋炙＞生品＞水润。可见不同辅料进行枳壳炮制时，对不同的成分影响较大，呈现不同的变化趋势，特别是对其含量较高的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷的含量变化呈现相同的变化趋势：水润＞麸炒＞盐炙＞醋炙＞生品；辅料可促进这些成分的合成，使其含量升高，从而改变其药理活性。

本研究建立了HPLC法测定枳壳炮制前后10种成分含量。该方法简便、可行，为枳壳及其炮制品质量评价提供了依据，为阐明枳壳药效物质基础奠定了基础。