黑果腺肋花楸果中原花青素和花色苷的提取及其结合牛磺胆酸钠能力研究

王旭辉 钟方丽 王晓林郭 浩 陈 浩

（吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）原产于北美，属蔷薇科腺肋花楸属灌木，果实具有多种生物活性[1]。目前，尚未见黑果腺肋花楸果实作为饲料添加剂在动物养殖方面大规模使用的报道，但已有学者对其在动物养殖中的应用开展了研究。原花青素食用安全，具有抗炎、抗氧化等功效[2]。田跃等[3]研究表明，在肉鸡日粮中添加葡萄籽原花青素可以提高肉鸡平均日增重，降低料重比，改善肉鸡机体的免疫能力。自然条件下游离的花青素较少，常与糖通过糖苷键形成花色苷[4]。花青素的抗氧化作用有助于维持畜禽生产过程中的氧化状态平衡，改善畜禽的健康[5]。黑果腺肋花楸果中多酚类物质主要包括花青素、原花青素等，在饲料中添加富含多酚的黑果腺肋花楸果渣，可提高羔羊肌肉组织的抗氧化能力[6]。黑果腺肋花楸果渣可作为改善猪生长性能、抗氧化酶活性和肉品质的饲料添加剂[7]。

关于黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取的研究已有报道[8-9]，但未见同时提取原花青素、花色苷的工艺研究。本试验以黑果腺肋花楸果为原料，拟采用单因素试验探究其原花青素、花色苷同时提取工艺并进行正交优化，与超声波、微波、超声波-微波协同、添加表面活性剂几种辅助方式提取效果作对比，测定提取物与牛磺胆酸钠的结合率，为黑果腺肋花楸在动物营养中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑果腺肋花楸果购自吉林省黑果花楸农业科技开发有限责任公司。

表儿茶素对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 仪器设备

TU-1950 紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司，XH-300UL-2 双频超声波微波紫外光组合催化合成仪购自北京祥鹄科技发展有限公司，FA3204B电子分析天平购自上海天美天平仪器有限公司，SK5210HP 超声波清洗器购自上海科导超声仪器有限公司，H1580 医用离心机购自长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取工艺

采用乙醇水溶液提取黑果腺肋花楸果中原花青素、花色苷，将黑果腺肋花楸果置于60 ℃干燥6～8 h，粉碎，过80目筛。称取黑果腺肋花楸果干粉2.0 g，在设定的提取条件下提取，定容，摇匀。

1.3.2 原花青素提取量的测定

1.3.2.1 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的表儿茶素对照品5.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，加适量无水甲醇溶解，定容，配制成质量浓度为0.5 g/L的对照品溶液。

1.3.2.2 供试品溶液的制备

按提取工艺进行提取，过滤，滤液用提取溶剂定容，即为供试品溶液。

1.3.2.3 检测波长的确定

吸取供试品溶液、对照品溶液各2.0 mL，置于25 mL棕色容量瓶中（锡箔包裹严实，避光），加入4%香草醛甲醇溶液5 mL，混合均匀，加入3 mL浓盐酸，混匀，甲醇定容，水浴30 ℃避光下显色30 min，以甲醇代替样品液为空白，按照紫外可见分光光度法，在300～700 nm进行波长扫描，确定检测波长为500 nm。

1.3.2.4 标准曲线的绘制

分别吸取表儿茶素对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，于25 mL 棕色容量瓶中，按照1.3.2.3的方法，以甲醇代替样品液为空白，按照紫外可见分光光度法测定500 nm处的吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标，表儿茶素质量浓度为横坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=7.088 1x+0.019 3，R2=0.999 4，表儿茶素在0.01～0.12 g/L之间线性良好。

1.3.2.5 原花青素提取量的计算

吸取每次试验所得供试品溶液2 mL，按照1.3.2.3 的方法，以未加显色剂的供试品溶液为空白，按照紫外可见分光光度法，测定500 nm处的吸光度值（A），根据标准曲线计算提取液中原花青素的浓度及提取量。

式中：W为原花青素提取量（mg/g）；c为根据吸光度值计算出的溶液质量浓度（g/L）；V为提取液体积（mL）；m为黑果腺肋花楸果粉取样量（g）。

1.3.3 花色苷提取量的测定

吸取2 份1 mL 供试品溶液，置于10 mL 容量瓶中，分别用pH值1.0、4.5的缓冲液稀释定容，40 ℃恒温水浴平衡30 min，分别在510、700 nm 波长下测定吸光度值[10-11]，计算花色苷的提取量。

式中：W为花色苷提取量（mg/g）；DF为稀释因子；A为吸光度，A=(A510nm-A700nm)pH值1.0-(A510nm-A700nm)pH值4.5；M为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量，取值为449.2；m为黑果腺肋花楸果粉取样量（g）；V为供试品溶液体积（mL）；ε为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的消光系数，取值为26 900；L为光程，取值为1 cm。

1.3.4 单因素试验

以黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷总提取量为考察指标，原花青素、花色苷提取量为次要指标，进行单因素提取试验。称取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，考察提取溶剂乙醇体积分数（0、10%、30%、50%、70%、90%）、提取温度（25、40、50、60、70、80 ℃）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）、液料比（5、10、20、30、40、50、60、70 mL/g）、提取次数（1、2、3、4、5）对原花青素、花色苷提取量及总提取量的影响。

1.3.5 正交试验设计

根据单因素试验结果，以原花青素、花色苷总提取量为考察指标，设计三因素三水平的正交试验，L9(34)正交试验因素水平设计见表1。试验中固定提取温度为80 ℃，提取次数为2次。

表1 L9（34）正交试验因素水平设计

1.3.6 工艺稳定性验证试验

根据正交试验确定的最佳提取工艺条件重复3 次，计算干浸膏的质量。

1.3.7 辅助提取方法研究

1.3.7.1 微波辅助提取称取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，微波功率设定为500 W，按照1.3.6 中的方法进行提取[12]，其中微波辅助提取的时间设定为30 min，提取结束后过滤，滤液用提取溶剂定容，测定滤液的吸光度值，计算提取量。

1.3.7.2 超声辅助提取

称取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，超声功率设定为300 W，按照1.3.6 中的方法进行提取[13]，超声辅助提取的时间设定为30 min。

1.3.7.3 微波-超声协同辅助

称取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，微波功率设定为500 W，超声功率设定为300 W，按照1.3.6 中的方法进行提取[12-13]，辅助提取的时间设定为30 min。

1.3.7.4 表面活性剂辅助

称取干燥的黑果腺肋花楸果粉2.0 g，加入果粉重量2%的表面活性剂十二烷基硫酸钠，按照1.3.6中的方法进行提取[13]。

1.3.8 体外结合牛磺胆酸钠能力的测定

1.3.8.1 溶液的配制

取Na2HPO435.8 g 溶于500 mL 的蒸馏水中，摇匀，得到溶液A；取NaH2PO47.8 g 溶于250 mL 的蒸馏水中，混匀，得到溶液B。吸取22.5 mL溶液A和77.5 mL溶液B，混匀，即为pH 值6.3 的磷酸盐缓冲液。称取牛磺胆酸钠0.016 g 溶解于磷酸盐缓冲液中，配制0.3 mmol/L 的牛磺胆酸钠标准溶液。

1.3.8.2 牛磺胆酸钠结合率的测定

称取25 mg黑果腺肋花楸果提取物，60%的乙醇溶液溶解，定容，即为供试品溶液。吸取供试品溶液1、2、3、4、5、6 mL分别置于具塞试管中，用60%乙醇溶液补至6 mL，分别加入4 mL牛磺胆酸钠标准溶液。以磷酸盐缓冲液替代黑果腺肋花楸果提取物溶液为空白对照组，以磷酸盐缓冲液替代牛磺胆酸钠标准溶液为对照组。试验组、对照组、空白对照组均在37 ℃水浴恒温振荡1 h，8 000 r/min 离心10 min。取2.5 mL 上清液，加入7.5 mL 60%硫酸，摇匀，70 ℃水浴20 min，取出，冰浴5 min，测定387 nm的吸光度，计算胆酸盐结合率[14]。

式中：A1为试验组的吸光度值；A0为对照组的吸光度值；A盐为空白对照组的吸光度值。

以供试品溶液与牛磺胆酸钠的结合率为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制曲线，计算供试品的IC50值。

1.4 数据统计与分析

试验重复3次，采用WPS和Origin 8软件进行数据处理，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂对提取量的影响（见图1）

图1 提取溶剂对提取量的影响

由图1 可知，随着乙醇体积分数的增加，原花青素提取量及总提取量均先增加后下降。当乙醇体积分数为30%时提取量最高。可能是因为原花青素作为多酚化合物，易溶于水和多数有机溶剂，当体系极性与原花青素极性相近时，更容易将其萃取[15]。花色苷提取量也呈先增加后下降的趋势，当乙醇体积分数为50%时提取量最大；当乙醇体积分数增大到90%时，提取量明显下降。可能花色苷具有水溶性，乙醇体积分数过高抑制了花色苷的溶出。综合考虑以原花青素、花色苷总提取量为主要考察指标，选择30%的乙醇水溶液进行后续试验。当乙醇体积分数在30%～70%之间提取量较高。因此，选择30%、50%、70% 3个水平进行正交试验。

2.1.2 提取温度对提取量的影响（见图2）

图2 提取温度对提取量的影响

由图2 可知，原花青素、花色苷提取量随温度升高不断增加，80 ℃时原花青素、花色苷及总提取量最高。乙醇的沸点为78.3 ℃，当提取温度为80 ℃时，提取溶剂已处于微沸状态，继续提高水浴温度意义不大，且水浴温度越高所需能耗越大。因此，选择80 ℃为提取温度进行后续试验。

2.1.3 提取时间对提取量的影响（见图3）

图3 提取时间对提取量的影响

由图3可知，原花青素提取量在0.5～1.5 h逐渐增加，1.5 h时提取量最高，1.5 h后随着提取时间的延长，提取量下降。可能是时间过短，原花青素提取不够充分，时间过长，原花青素酚羟基被破坏，影响提取量[16]。花色苷提取量0.5 h最大，且随提取时间延长变化不大。原花青素、花色苷总提取量1.5 h时最大，综合考虑选择1.5 h为提取时间进行后续试验。提取时间大于1.5 h后，总提取量有所下降，而在0.5～1.5 h 之间总提取量较高，且差别不明显。因此，选择0.5、1.0、1.5 h 3个水平进行正交试验。

2.1.4 液料比对提取量的影响（见图4）

图4 液料比对提取量的影响

由图4 可知，原花青素提取量随液料比增加呈增加趋势，液料比为70 mL/g时提取量最高。随着溶剂用量的增加，溶质不断从原料中析出，当液料比达到70 mL/g时，溶质析出呈最高水平，较液料比60 mL/g 时变化不大。液料比为40 mL/g时，花色苷提取量最大，增加液料比提取量略有下降，但总体变化不大。而总提取量液料比70 mL/g时最大，因此，选择液料比70 mL/g进行后续实验。总提取量随着液料比加大而提高，当液料比达到60 mL/g 后，虽然总提取量随着液料比加大而继续提高，但提高幅度有限。因此，选择65、70、75 mL/g 3个水平进行正交试验。

2.1.5 提取次数对提取量的影响（见图5）

图5 提取次数对提取量的影响

由图5 可知，第3 次提取原花青素提取量为0，花色苷提取量明显变小。前2 次提取原花青素、花色苷总提取量之和为10.87 mg/g，因此，选择提取2次进行试验。

2.2 正交试验及方差分析结果（见表2、表3）

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

由表2可知，根据R值判断各因素影响提取量大小排序为B＞C＞A，表明提取时间对提取量的影响最大，其次为液料比，乙醇体积分数影响最小。最优条件为A2B3C1，即提取溶剂为50%的乙醇水溶液、提取时间为1.5 h、提取液料比为65 mL/g、提取温度为80 ℃、连续提取2次。

由表3 方差分析可知，各因素对总提取量无显著性差异。

2.3 工艺稳定性试验结果（见表4）

表4 工艺稳定性试验结果

由表4 可知，3 批样品中原花青素提取量平均值为10.37 mg/g，花色苷提取量平均值为0.88 mg/g，总提取量平均值为11.25 mg/g。3批试验结果原花青素、花色苷总提取量接近，平行性较好，证明该提取条件稳定，可以作为黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷同时提取的工艺参数。

2.4 辅助试验结果（见表5）

由表4 可知，辅助试验中原花青素及总提取量均比工艺验证批次平均提取量略高，花色苷提取量微波辅助高于工艺验证批次平均提取量，其他与工艺验证平均提取量相同或略低，花色苷提取效果受辅助条件影响更小。几种辅助条件下原花青素及总提取量升高，可能是因为超声波的机械效应、空化效应和热效应增大了溶剂分子的运动速度和穿透力，加快了原花青素的提取。在微波场中，由于微波的辐射作用，物料内部温度迅速升高，压力增大，使原花青素快速溶出[17]。表面活性剂的双亲结构可降低溶液的表面张力，增强溶剂对物料润湿和渗透作用，起增溶效果，加快了原花青素的提取[18]。

2.5 体外结合牛磺胆酸钠能力试验的结果（见图6）

图6 牛磺胆酸钠结合率结果

由图6 可知，在一定质量浓度范围内，黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取物与牛磺胆酸钠结合率（y，%），随着加入样品质量浓度（x，g/L）的增大而逐渐增大，且呈线性关系，拟合方程为：y=25.24x+29.151，IC50值为0.83 g/L，说明黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷提取物具有与牛磺胆酸钠结合的能力。

3 结论

本试验采用紫外分光光度法、pH示差法分别测定黑果腺肋花楸果提取液中原花青素、花色苷的含量，通过单因素和正交试验优化了黑果腺肋花楸果原花青素、花色苷同时提取工艺，最佳工艺条件为提取溶剂为50%的乙醇水溶液，时间为1.5 h、温度为80 ℃、液料比为65 mL/g、提取为2 次，在优化条件下原花青素提取量为10.37 mg/g、花色苷提取量为0.88 mg/g，总提取量为11.25 mg/g。黑果腺肋花楸果提取物与牛磺胆酸钠具有结合能力，IC50值为0.83 g/L。